【圖3】始發(fā)態(tài)PSC、4CL和8CLC微量/單細(xì)胞全基因組甲基化測序甲基化水平分析

無論是簡化基因組甲基化測序結(jié)果還是微量細(xì)胞全基因組甲基化測序，原始多潛能基因和全能基因甲基化水平都保持相對一致水平(圖4)。

【圖4】全基因組甲基化測序分析原始多潛能基因（藍(lán)色）和全能基因（紅色）甲基化狀態(tài)改變

為進(jìn)一步探索8CLC細(xì)胞形成分子機(jī)制，研究者分析了不同細(xì)胞狀態(tài)的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)449個基因表達(dá)在8CLC中上調(diào)，幾乎無下調(diào)基因。其中DPPA3和TPRX1基因處于上調(diào)前五基因內(nèi)。已知DPPA3與UHRF1及DNMT1作用，控制小鼠卵母細(xì)胞被動去甲基化過程。DPPA3也通過調(diào)控印記基因甲基化修飾，參與到小鼠體細(xì)胞重編程過程。作者敲除DPPA3基因阻斷了始發(fā)態(tài)PSC細(xì)胞向原始態(tài)PSC細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。敲除TPRX1基因阻斷了階段式e4CL和直接e4CL誘導(dǎo)8細(xì)胞胚胎標(biāo)志物的形成，但是對4CL 12天培養(yǎng)原始態(tài)PSC的形成影響不大。與上述結(jié)果相對應(yīng)，DPPA3基因敲除后，4CL 12天和e4CL 直接7天細(xì)胞基因組DNA甲基化整體升高（圖5a）。DPPA5和KHDC3L等原始多潛能基因，以及TPRX1和TRIM43等全能基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域DNA甲基化在DPPA3敲除后都升高（圖5b-d）。DPPA3敲除后，基因間區(qū)DNA甲基化同樣升高（圖5e），提示其作為遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)區(qū)域和3D染色質(zhì)相互作用的潛在位點(diǎn) 。表明8CLC轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞功能和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重組發(fā)生了重大變化。

【圖5】DPPA3基因敲除后不同細(xì)胞甲基化變化

02  疾病發(fā)生發(fā)展及標(biāo)志物篩選

發(fā)表雜志：Journal of Clinical Investigation

影響因子:  IF 19.456/1區(qū)

合作單位：中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院等

該研究首次揭示鐵離子過載通過調(diào)節(jié)DNA去甲基化促進(jìn)以濾泡輔助性T細(xì)胞（Follicular helper T cells，Tfh cells）為代表的致病性T細(xì)胞異常分化，從而加重自身免疫抗體產(chǎn)生及系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）發(fā)病，提示T細(xì)胞內(nèi)鐵離子可能是治療SLE的新靶點(diǎn)。

背景：

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，致病性T細(xì)胞的異常擴(kuò)增在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病中起到重要作用。特別是濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh cells）輔助B細(xì)胞活化分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量自身抗體。SLE患者體內(nèi)T細(xì)胞異?；罨只臋C(jī)制仍未闡明。鐵是體內(nèi)一種重要的微量元素，參與包括DNA復(fù)制、ROS產(chǎn)生等許多生物學(xué)過程。鐵離子水平也會影響免疫反應(yīng)和疫苗接種，但鐵離子在自身免疫性疾病中的作用尚不清楚。目前暫無相關(guān)研究報道鐵離子在Tfh細(xì)胞的分化中的調(diào)控作用。

方法：

患者招募

從門診皮膚科診所和住院病房招募193名SLE患者，根據(jù)狼瘡活動指數(shù)(SLEDAI)評分評估活動類別：無效（SLEDAI≤ 4），活躍（SLEDAI>4）。

Pristane誘導(dǎo)狼瘡小鼠模型的建立

為誘導(dǎo)狼瘡樣疾病，給12周齡雌性WT和miR-21 cKO小鼠腹腔注射500μL的Pristane（Sigma）。在Pristane刺激觀察期間每周檢測尿蛋白。處理3個月后處死小鼠用于分析。從DLN和脾臟分離細(xì)胞、收集血清、將腎組織用福爾馬林固定并包埋在石蠟中。

RNA-seq

從WT和miR-21 cKO小鼠中分離脾原始CD4+T細(xì)胞，在Tfh極化條件下培養(yǎng)5天。從Tfh細(xì)胞中提取總RNA進(jìn)行RNA-seq測序。

MeDIP-seq和hMeDIP-seq測序分析

從誘導(dǎo)的Tfh細(xì)胞中分離DNA,1μg起始基因組DNA片段平均大小為300bp。在深圳市易基因科技有限公司進(jìn)行DNA甲基化免疫共沉淀測序（MeDIP-seq）和DNA羥甲基化免疫共沉淀測序（hMeDIP-seq）分析。

結(jié)果：

該研究首次揭示鐵離子過載通過調(diào)節(jié)DNA去甲基化促進(jìn)以Tfh細(xì)胞為代表的致病性T細(xì)胞異常分化，從而加重自身免疫抗體產(chǎn)生及SLE發(fā)病，提示T細(xì)胞內(nèi)鐵離子可能是治療SLE的新靶點(diǎn)。研究人員首先發(fā)現(xiàn)SLE患者CD4+T細(xì)胞中的Fe2+水平顯著升高，與Tfh細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)。進(jìn)一步通過高鐵飲食實(shí)驗(yàn)證明提高鐵離子水平有利于小鼠體內(nèi)Tfh細(xì)胞和GCB細(xì)胞擴(kuò)增，增加CD4+T細(xì)胞炎癥因子IFN-γ和IL-17A分泌，促進(jìn)MRL/lpr狼瘡小鼠體內(nèi)自身抗體產(chǎn)生，加重狼瘡小鼠疾病表型。補(bǔ)充鐵離子可以促進(jìn)Tfh細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化。相反，用2,5-二羥基苯甲酸和鐵螯合劑CPX可以減少細(xì)胞內(nèi)的鐵離子蓄積，顯著抑制Tfh細(xì)胞分化。機(jī)制方面，研究揭示miR-21/BDH2通路在調(diào)控T細(xì)胞內(nèi)鐵離子蓄積以及Tfh細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。過表達(dá)miR-21或干擾BDH2表達(dá)，可以增強(qiáng)TET蛋白酶活性，導(dǎo)致Tfh細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BCL6基因啟動子低甲基化，促進(jìn)BCL6基因表達(dá)。

關(guān)鍵圖形：

圖：miR-21/BDH2通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵離子促進(jìn)BCL6基因的DNA羥甲基化

在用Agomir-21或siRNA-BDH2轉(zhuǎn)染的Tfh細(xì)胞中使用MeDIP-Seq和hMeDIP-Seq驗(yàn)證了BCL6啟動子區(qū)域的5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）分布變化。

圖：BCL6基因的5mC MeDIP-seq和5hmC hMeDIPseq的代表性IGV分析

發(fā)表雜志：Environment International

影響因子:  IF 13.352 /1區(qū)

合作單位：陸軍醫(yī)科大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所

該研究通過對小鼠睪丸組織的全基因組重亞硫酸鹽測序（Whole gene bisulfite sequencing,WGBS）與對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）聯(lián)合分析，鑒定出與類固醇生成和精子發(fā)生過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，揭示了PM2.5導(dǎo)致男性生殖障礙的潛在DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。

摘要

環(huán)境細(xì)顆粒物（PM2.5）對男性生殖健康的影響已引起廣泛關(guān)注，其損害的具體潛在機(jī)制仍不清楚，需要在新的方向進(jìn)行更多研究。先前研究表明，DNA甲基化在男性生殖發(fā)育中起著重要作用，也易受環(huán)境影響，然而對于DNA甲基化參與PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖毒性作用還沒有足夠研究。為此，本研究建立一個實(shí)時PM2.5暴露模型，揭示了PM2.5暴露可能導(dǎo)致睪丸功能障礙，包括精子發(fā)生障礙和類固醇激素功能障礙。睪丸5-甲基胞嘧啶（5mC）全基因組水平降低表明DNA甲基化可能與PM2.5暴露誘導(dǎo)的睪丸損傷有關(guān)。進(jìn)一步的全基因組甲基化分析揭示了睪丸DNA的基因組低甲基化，并在CAP組與UA組和FA組中發(fā)現(xiàn)1000多個差異甲基化區(qū)域（DMR），表明PM2.5暴露（即使低劑量）可以調(diào)控睪丸甲基化。此外，甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析鑒定出一些關(guān)鍵甲基化基因和網(wǎng)絡(luò)，這些基因和網(wǎng)絡(luò)可能參與精子發(fā)生和類固醇激素的合成。關(guān)鍵基因尤其是Cyp11a1和Pax8的睪丸甲基化水平升高，隨后表達(dá)水平降低可能會損害睪酮和精子生成過程。本研究為DNA甲基化可能參與PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖損傷提供了基礎(chǔ)知識和新見解。

圖形摘要

睪丸全基因組DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析鑒定了與類固醇生成和精子發(fā)生過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，這可能是PM2.5引起的男性生殖障礙中DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。

研究思路

材料方法

8周齡C57BL/6雄性小鼠，過濾空氣組（FA），未過濾空氣組（UA）和濃縮PM2.5 組(CAP)。FA組為高效顆?？諝膺^濾器過濾的環(huán)境空氣，UA組為未經(jīng)過濾的環(huán)境空氣，CAP組為細(xì)顆粒物（PM2.5）暴露環(huán)境空氣。

從小鼠眼眶叢中獲得血液，稱重睪丸和附睪，分別固定在Bouin溶液中進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和在液氮中速凍-80°C儲存。

從睪丸組織中分離提取RNA、DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行全基因組重亞硫酸鹽測序 （WGBS）分析、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）和Western Blot實(shí)驗(yàn)，WGBS為每組構(gòu)建兩個庫，每個庫包含來自四只小鼠的合并睪丸DNA。

圖1：PM2.5暴露表征

（A）PM2.5暴露程序示意圖。（B）實(shí)驗(yàn)期間各組PM2.5濃度。（C） PM2.5中無機(jī)離子水平。（D）PM2.5中多環(huán)芳烴濃度。（E）PM2.5中痕量金屬（trace metal）濃度。

研究結(jié)果

（1）PM2.5暴露導(dǎo)致精子質(zhì)量下降和精子發(fā)生損傷

圖2：PM2.5暴露導(dǎo)致精子發(fā)生障礙

（A）睪丸的典型病理圖像。三角形（基底膜中斷），黑色箭頭（空泡化）。

（B-C）在VII期曲細(xì)精管（n=15）中檢測曲細(xì)精管直徑（B）和上皮高度（C）的精子發(fā)生參數(shù)。

（D-H）每個VII期曲細(xì)精管的Sertoli細(xì)胞（D）、精原細(xì)胞（E）、粗線期精母細(xì)胞（F）、圓形精子細(xì)胞（G）和總生殖細(xì)胞（H）的計數(shù)（n=15）。

（I-L）精原細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（I）、粗線期精母細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（J）、圓形精母細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（K）、總生殖細(xì)胞/Sertali細(xì)胞比率（L）（n=15）。

單向方差分析，然后Tukey多重比較。與FA處理組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

（2）PM2.5暴露誘發(fā)睪丸類固醇激素功能障礙

圖3：PM2.5暴露誘發(fā)睪丸內(nèi)分泌功能障礙

（A-C）血清中的激素。睪酮(T)（A）、促黃體生成素(LH)（B）、卵泡刺激素(FSH)（C）的水平

（D）血清T/LH在血清中的比值（D）（n=15）。

（E-G）睪丸水平，睪酮(T)（E）、LH（F）、FSH（G）（n=7）。

（H） 睪丸T/LH比值（n=7）。

（3）PM2.5暴露誘導(dǎo)睪丸全基因組低甲基化

圖4：PM2.5暴露改變了睪丸中的甲基化模式

（A） ELISA檢測到的睪丸DNA的全基因組5mC甲基化水平。

（B） 基因組甲基化測序示意圖。

（C） 通過WGBS檢測睪丸基因組中所有CpG位點(diǎn)的全基因組DNA甲基化水平。

（D） 功能基因組區(qū)域mm10內(nèi)5mC相對密度的基因組特征。

（E） PM2.5暴露組與FA組DMR鑒定。

（F和H） CAP組（F）和UA組（H）染色體上的顯著DMR。

（G和I） CAP組（G）和UA組（I）中鑒定的DMR基因組位置（啟動子、5’UTR、外顯子、內(nèi)含子、3’UTR、基因間）（上：高DMR；下：低DMR）。

（J） DMR相關(guān)基因（DMG）生物過程的富集分析。點(diǎn)的顏色表示P值，點(diǎn)的大小是給定生物過程中的富集分?jǐn)?shù)。

（4）基于DMR的功能相關(guān)基因

圖5：PM2.5誘導(dǎo)的啟動子相關(guān)DMR變化表征

（A） FA組、UA組和CAP組中啟動子連接的DMR相關(guān)基因（PDMG）熱圖。塊的顏色表示相對甲基化水平。紅色表示高甲基化，藍(lán)色表示低甲基化。

（B） 與FA組相比，CAP組中PDMGs的最高生物過程（top biological process）氣泡圖。每個圓圈表示不同的生物過程，大小表示富集-sore。X軸表示總差異基因中高甲基化和低甲基化基因數(shù)量差異比例。氣泡越向右，表示通路中高甲基化基因比例就越高。

（C） 啟動子區(qū)域的DMG以及染色體位置的曼哈頓圖。X軸代表染色體。Y軸是-log10 FDR。

（D） DNA甲基化peaks可視化Meioc基因座。橙色表示DMR區(qū)域。

（5）PM2.5暴露破壞了睪丸的轉(zhuǎn)錄組特征

圖6：PM2.5暴露破壞睪丸的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征

（A） 實(shí)驗(yàn)設(shè)計圖。

（B） FA組、UA組和CAP組中DEG熱圖。

（C） DEG的KEGG分析。

（D） FA組和CAP組中類固醇激素生物合成過程基因組的GSEA分析。

（E） 睪酮生物合成通路分子圖。

（F） 與類固醇生成和精子發(fā)生相關(guān)的DEGs熱圖。塊的顏色表示每組的基因表達(dá)水平。

（6）DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，鑒定與PM2.5暴露相關(guān)的關(guān)鍵甲基化基因

圖7：WGBS和RNA-seq圖譜聯(lián)合分析揭示了PM2.5誘導(dǎo)的睪丸損傷中候選表觀遺傳基因和網(wǎng)絡(luò)失調(diào)

（A）與類固醇生物合成和精子發(fā)生相關(guān)的候選功能基因的啟動子甲基化和表達(dá)水平熱圖。

（B） 參與生殖功能的候選基因網(wǎng)絡(luò)。

（C） RT-PCR驗(yàn)證睪丸中候選類固醇生成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平（n=6）。

（D） RT-PCR驗(yàn)證睪丸中候選精子發(fā)生相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平（n=6）。

（E） Cyp11a1基因DMR內(nèi)代表性CpG甲基化譜。

（F）  Pax8基因DMR內(nèi)代表性CpG甲基化譜。

（G） western blot分析睪丸候選基因的蛋白表達(dá)水平。

（H） CYP11A1和PAX8的蛋白質(zhì)定量分析（n=6）。

以上就是3篇易基因2022年度在細(xì)胞分化與發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展及標(biāo)志物篩選、環(huán)境因素暴露與響應(yīng)三個不同應(yīng)用方向的DNA甲基化研究項目文章，未來易基因?qū)懈嘣?span>DNA甲基化、RNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象等表觀組學(xué)研究成果展現(xiàn)，敬請期待。

參考文獻(xiàn)：

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（2）Gao X, Song Y, Wu J, Lu S, Min X, Liu L, Hu L, Zheng M, Du P, Yu Y, Long H, Wu H, Jia S, Yu D, Lu Q, Zhao M. Iron-dependent epigenetic modulation promotes pathogenic T cell differentiation in lupus. J Clin Invest. 2022 May 2;132(9) pii: 152345.

（3）Zhang Z, Wang J, Shi F, Li Y, Zou P, Tang Y, Liu C, Wang Y, Ling X, Sun L, Liu C, Zhang Y, Gao F, Chen Q, Ao L, Han F, Liu J, Cao J. Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure. Environ Int. 2022 Sep 24;169:107544.

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