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精原干細胞移植（Spermatogonial stem cell transplantation，SSCT）被提議作為兒童癌癥幸存者的生育療法。SSCT首先冷凍保存睪丸活檢，然后再進行性腺毒性治療（如癌癥治療）。當兒童癌癥幸存者成年并想要親生孩子時，可以將活檢組織解凍并在體外增殖精原干細胞（SSC），隨后將其自動移植回睪丸。然而，長期增殖過程中的培養(yǎng)應(yīng)激可能會導(dǎo)致SSC的表觀遺傳學(xué)變化，如DNA甲基化變化，并可能遺傳給SSCT后出生的子代。因此，在臨床實施這種新型細胞療法之前，SSCT需要對衍生子代進行詳細的臨床前表觀遺傳學(xué)評估。

 

2023年04月07日，荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)UMC生殖醫(yī)學(xué)中心生殖生物學(xué)實驗室Callista L Mulder團隊在《Clin Epigenetics》雜志發(fā)表了題為“Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells”的研究論文，該研究通過使用簡化甲基化測序（RRBS）在多代小鼠模型中研究了SSCT衍生子代具有體外增殖SSC精子的DNA甲基化狀態(tài)。

標題：Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells在長期培養(yǎng)的精原干細胞移植后出生的小鼠后代中，精子DNA甲基化水平穩(wěn)定

時間：2023.04.07

期刊：Clinical Epigenetics

影響因子：IF 7.259

技術(shù)平臺：RRBS、BSP、RT-qPCR等

樣本實驗：

研究設(shè)計：SSCT子代的多代小鼠模型

F0：移植小鼠，F1：SSCT后出生的第一代，F2：SSCT后親本出生的第二代，F2/M：F2由母系產(chǎn)生，F2/P：F2由父系產(chǎn)生。從代際子代的5只雄性小鼠采集附睪精子，比較DNA甲基化狀態(tài)（F0的n=3，F1和F2的每個子代亞組n=5）

 

研究結(jié)果：

通過對第一代和第二代SSCT出生小鼠子代的精子進行RRBS DNA甲基化測序分析，以此來評估SSCT衍生子代的分子表觀遺傳穩(wěn)定性，并將其與對照組精子進行比較分析。研究結(jié)果表明，在所有子代中，DNA甲基化差異比例占總CpG和甲基化區(qū)域不到0.5%。所有樣品的無監(jiān)督聚類分析沒有顯示出基于甲基化差異模式的明顯分組。對與對照組相比在多代SSCT子代中顯著變化的少數(shù)單個基因用定量亞硫酸鹽Sanger測序（BSP）和RT-qPCR在不同器官中進行了驗證。僅Tal2的差異甲基化得到證實，與對照F1相比，Tal2在SSCT子代的精子中低甲基化，且在SSCT F1子代的卵巢中表現(xiàn)出更高的基因表達。表明在F1代和F2代精子中，SSCT衍生的子代和對照組之間的DNA甲基化沒有顯著差異。

 

研究圖表：

圖1：所有樣品平均甲基化的無監(jiān)督聚類熱圖。

所有樣本的熱圖聚類基于每個樣本之間的顯著差異甲基化（F0 n=3在，F1和F2 子代亞組n=5）和所有樣品的平均甲基化（duplo），熱圖中包括前500個變化最大的DMR（高甲基化和低甲基化）的中淺灰色的最后2行

表1：對照組F0/對照組F1與SSCT組/SSCT亞組之間顯著差異的所有DMC和DMR

圖2：與對照組F1相比，SSCT F1和SSCT F2的CpG位點的差異分析（DMC）。

A.      火山圖顯示了SSCT樣品和對照樣品之間CpG甲基化模式變化的CpG數(shù)量，顯著高于或低于25%差異截止值并考慮了q值閾值為0.01。x軸和y軸上的值分別是校正后p值的甲基化差異百分比和-log10。

B.      代際間的差異甲基化CpG（DMC）在DNA區(qū)域外顯子、內(nèi)含子、啟動子和基因間區(qū)域的分布。

 

圖3：與對照F1相比，SSCT F1和SSCT F2子代的DMR差異分析。

A.        火山圖顯示了SSCT樣品和對照樣品之間甲基化模式改變的DMR數(shù)量。

B.        DNA區(qū)域外顯子、內(nèi)含子、啟動子和基因間區(qū)域的差異甲基化區(qū)域（DMR）分布。

 

表2：在SSCT F0、SSCT F1和SSCT F2代際之間的外顯子和啟動子區(qū)域中共有的DMR變化基因（粗體字體），這些基因?qū)⑦M一步驗證

圖4：對單個精子樣本的Tal2基因的RRBS結(jié)果進行BSP驗證。整體CpG平均值如下：對照F1 24.7%±4.4%、SSCT F1 17.4%±4.5%、SSCT F2/M 22.7%±9.3%、SSCT F2/P 14.5%±3.2%表現(xiàn)出SSCT和對照之間甲基化差異最大（10%）。

圖5：RT-qPCR比較Tal2基因表達分析

F1、F2/M和F2/P中對照組F1和SSCT子代之間的睪丸（A）、卵巢（B）和腎（C）的平均表達率。條形圖和ANOVA的統(tǒng)計分析以及Tukey事后檢驗代表了代際組之間的RNA表達，（每個器官n=5，F1和F2中的每個子代亞組，在技術(shù)三倍體中進行RT-PCR）*兩組間觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著差異（p?<?0.05)。

易基因小結(jié)：

本研究可以得出結(jié)論，SSCT衍生子代的精子中存在一些表觀“突變”（epimutations），但可以放心的是，這些“突變”沒有重大的病理影響。一旦人類SSC培養(yǎng)得到優(yōu)化并證實表觀遺傳學(xué)安全，這項關(guān)于表觀遺傳穩(wěn)定性的研究以及之前關(guān)于多代SSCT子代一般健康狀況的研究可用于申請在Ⅰ期臨床試驗中引入SSCT的倫理批準以及對兒童的隨訪。

 

 

關(guān)于易基因簡化基因組甲基化測序（RRBS）研究解決方案

簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內(nèi)切酶對基因組進行酶切，富集啟動子及CpG島等重要的表觀調(diào)控區(qū)域并進行重亞硫酸鹽測序。該技術(shù)顯著提高了高CpG區(qū)域的測序深度，在CpG島、啟動子區(qū)域和增強子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準確、高效、經(jīng)濟的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

 

為適應(yīng)科研技術(shù)的需要，易基因進一步開發(fā)了可在更大區(qū)域內(nèi)捕獲CpG位點的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。

 

為助力適用低起始量DNA樣本（5ng）量多維度甲基化分析，易基因開發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動子、增強子、CTCF結(jié)合位點的甲基化靶向基因組測序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實現(xiàn)了高靈敏度和微量樣本復(fù)用檢測，使其具有高度可擴展性，并適用于有限的樣本和單個細胞基因組CG位點覆蓋高達15M以上。

 

技術(shù)優(yōu)勢：

?  起始量：100ng gDNA；

?  單堿基分辨率；

?  多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性可達到85%-95%、測序區(qū)域針對高CpG調(diào)控區(qū)域，數(shù)據(jù)利用率更高；

?  針對性強，成本較低；

?  基因組CG位點覆蓋高達10-15M，顯著優(yōu)于850K芯片。

 

應(yīng)用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS廣泛應(yīng)用于動物，要求全基因組掃描（覆蓋關(guān)鍵調(diào)控位點）的：

?  隊列研究、疾病分子分型、臨床樣本的甲基化 Biomarker 篩選

?  復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)病機制等甲基化研究

?  模式動物發(fā)育和疾病甲基化研究

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參考文獻：

Serrano JB, Tabeling NC, de Winter-Korver CM, van Daalen SKM, van Pelt AMM, Mulder CL. Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells. Clin Epigenetics. 2023 Apr 7;15(1):58.

 

 

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