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現(xiàn)代農(nóng)業(yè)通過簡化生態(tài)系統(tǒng)、引入新宿主物種和減少作物遺傳多樣性來影響植物病毒的出現(xiàn)。因此，更好理解農(nóng)業(yè)生態(tài)中種植和未種植群落中的病毒分布，以及它們之間的病毒交換至關(guān)重要。2023年03月14日，《Microbiol Spectr》雜志發(fā)表了題為“Long-Term Anthropogenic Management and Associated Loss of Plant Diversity Deeply Impact Virome Richness and Composition of Poaceae Communities”的研究論文，研究通過對三種禾本科（Poaceae）群落類型進行宏病毒組測序分析，揭示了長期人為管理和植物多樣性破壞會嚴(yán)重影響禾本科植物群落的病毒組豐度和組成。

標(biāo)題：Long-Term Anthropogenic Management and Associated Loss of Plant Diversity Deeply Impact Virome Richness and Composition of Poaceae Communities（長期人為管理和植物多樣性破壞會嚴(yán)重影響禾本科植物群落的病毒組豐度和組成）

期刊：Microbiology Spectrum

影響因子：IF 9.043

發(fā)表時間：2023.03.14

 

研究摘要：

本研究通過表征三種不同物種豐富度和管理強度梯度的禾本科群落類型的病毒組（從管理強度高的作物單一種植到管理強度低的物種豐富度高），從而推進對這一領(lǐng)域的基本理解。研究人員在兩年多的時間里對950株草地野生和種植的禾本科植物進行大規(guī)模研究，將非靶向病毒組（virome）分析與病毒種類水平結(jié)合，并靶向檢測三種植物病毒。

病毒宏基因組學(xué)的深度測序揭示了：

（i）多樣化且基本未知的禾本科植物病毒組（至少51種病毒物種或分類群），具有持久性病毒富集；

（ii）群落內(nèi)的病毒組豐度隨著物種豐富度的增加而增加；

（iii）病毒組豐度在不同時間比較穩(wěn)定，但病毒種類變異性大；

（iv）植物群落和物種之間病毒流行、多種感染和空間分布的對比模式。

研究結(jié)果突出了自然界中植物病毒群落的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，并表明了人為管理對病毒分布和流行的影響。

 

研究重要性：

由于先前研究主要在種植植物中研究病毒，因此對人為管理較少植被中的病毒多樣性和生態(tài)學(xué)、人為管理和農(nóng)業(yè)對病毒組組成的影響知之甚少。由于禾本科（grass family）植物分布在世界各地的農(nóng)業(yè)生態(tài)梯度中，對糧食安全和保護至關(guān)重要，并且可能被多種病毒感染，因此以禾本科植物為主的群落為研究這些生態(tài)問題提供了寶貴的機會。本研究利用多層次分析，同時考慮植物群落、單株植物、病毒種類和單倍型遺傳多樣性，以擴大對禾本科植物病毒組的理解，并評估了研究區(qū)域農(nóng)業(yè)生態(tài)中宿主-寄生生物豐富度的關(guān)系。研究揭示了草地多樣性和土地利用對病毒群落組成及其生活史策略的影響，表明了管理較少的草地群落中植物-病毒互作的復(fù)雜性，如與理論預(yù)測相比，病毒流行率、多重病毒合并感染的比例更高。

 

研究方法

在2017和2018年兩年的時間，對相距10公里的3個地點（Antheit、Héron、Latinne）分別抽樣采集麥田（植物物種豐富度低，管理強度高）、集約化牧場（物種豐富度和管理強度均中等）和自然草地（物種豐富度高，管理強度低）的禾本科植物各50株；并在2018年采集了附近一塊具有真菌感染癥狀的麥田中的50株禾本科植物。對一共19次采集的樣品分別進行病毒樣顆粒富集后提取總核酸（包括DNA和RNA病毒），進行宏病毒組測序分析。

圖1：所研究的不同群落和地點的信息表（GPS位置、代碼、規(guī)模、歷史、農(nóng)業(yè)管理和干擾因素）。下圖為Antheit（a），Héron（B）和Latine（C）位置，主要分析了三個相鄰的生態(tài)系統(tǒng)：大麥或麥田（橙色）、集約化牧場（紫色）和物種豐富度高的草地（藍色）。2018年在Antheit對另一塊 6行的大麥田進行采樣（綠色）。

 

結(jié)果

（1）病毒宏基因組測序揭示了禾本科植物中多樣化且大部分未知的病毒組

為評估每個群落中的病毒組，采樣了24個禾本科物種的950株植物，并對每個群落的50個樣本使用病毒宏基因組測序方法（virion-associated nucleic acids ,VANA）。文庫平均包含17.9%的病毒reads（從0%~78%）。由于在禾本科植物樣本中檢測到的外來靶序列（PLRV、BSV）平均占文庫中總reads的0.01%，因此觀察到低水平的交叉樣本污染，以此作為本研究的檢測閾值（不檢測低于此水平病毒）。組裝了51個共有植物病毒基因組（1496 - 13876?核苷酸(nt)長度），覆蓋了在相應(yīng)屬或科中描述ORF中的47個。研究鑒定出四個不完整的病毒基因組（1497nt - 6785nt長度）：Closterovirus病毒、Rymovirus病毒、Varicosavirus病毒、Amalgavirus病毒。這51種RNA病毒被比對到代表21個病毒屬的16個病毒家族（表1）。分析結(jié)果表明，超2/3的禾本科植物病毒組在很大程度上仍然未知（n=37），這些新病毒物種主要是在所有三種群落類型中均發(fā)現(xiàn)的持久性病毒和真菌病毒（3種novel alphachrysoviruses、10種novel Partitiviruses和13種novel totiviruses），不同時間的病毒組比較顯示，77%的病毒種類在兩個采樣年份都被檢測到（植物病毒為74%，真菌病毒為79%）。當(dāng)只考慮長期植物群落（牧場和草地）時，這一值增加到85%。

表1：在禾本科植物群落（麥田、放牧牧場和割草草地）中檢測到的不同病毒科、屬和種

 

（2）禾本科植物群落與病毒組豐度或組成之間的關(guān)系

HTS的初步結(jié)果揭示了植物群落中病毒組豐度的對比水平。麥田、牧場和草地的病毒種類群豐度存在顯著差異（在病毒科、屬和種水平上，P<0.001，Kruskall-Wallis檢驗）。在麥田中發(fā)現(xiàn)的病毒種類很少或根本沒有，而在更多樣化的群落中觀察到病毒組多樣化，在草地中檢測到的病毒種類多達22種（圖2）。牧場和草地在科和屬水平上的病毒組豐度沒有顯著差異（P=0.456和0.419，Mann-Whitney檢驗）。但在物種水平上，草地的多樣性略高于牧場（Mann-Whitney檢驗，P=0.078，排除HG1時P=0.010）。使用線性回歸模型來顯示植物物種豐富度和病毒組豐度之間的關(guān)系（病毒組=0.60?+?0.62植物種類，R2=74.3%，P=0.000），病毒屬豐富度（病毒屬=0.55+0.82植物種類，R2=72.9%，P=0.000），以及病毒物種豐富度（病毒物種=0.22+1.57植物種類，R2=76.0%，P=0.000）（圖2）。

圖2：2年間研究中植物群落（橙色圓麥田、紫色三角形牧場、藍色方塊草地）的禾本科植物物種豐富度與病毒種類豐富度之間的關(guān)系。2017年研究的Héron草地采用不同的割草管理，以紅色圓圈標(biāo)記。排除Héron草地進一步將R2值從76.0%提高到88.2%。

 

禾本科植物群落中的病毒組組成通過對每個草地群落中鑒定的病毒種類進行網(wǎng)絡(luò)分析來可視化（圖3），并對草地和牧場的病毒和植物兩個維度進行聚類分析，以突出任何群落聚類或病毒共生模式（圖4）。

圖3：對三個地點2年研究的禾本科植物群落（麥田、牧場、草地）中鑒定的病毒物種進行網(wǎng)絡(luò)分析。病毒種類（紅色方塊）、植物群落（彩色球）。根據(jù)每個病毒物種（非持久性病毒、持久性病毒和真菌病毒）的假定方式著色。

 

圖4：植物和病毒兩個維度的分層聚類分析。列表示2017年(1)和2018年(2) 兩年間的不同地點（Antheit(A)，Héron(H)和Latine(L)）兩個不同的非種植禾本科植物群落分析（牧場(P)和草地(G)）。行表示檢測到的不同病毒種類。右側(cè)樹狀圖突出顯示了兩組主要的共生病毒組。

（3）在人為管理較少的植物群落中，病毒流行率和多重感染率更高

為完成禾本科植物庫病毒組組成提供的第一個生態(tài)信息，研究分析了3個樣品地塊內(nèi)的病毒流行率、病毒共感染和病毒分布。對2018年在Antheit地點采集的單株植物HTS檢測到的三種病毒進行病毒檢測：barley yellow dwarf virus-PAV病毒 (BYDV-PAV，所有群落中均檢測到）和兩種新secovirids病毒（Poacee Liege nepovirus A病毒(PoLNVA)和Poacee Liege virus 1病毒(PoLV1)，在牧場和草地中檢測到）。分析了草地、牧場、6行大麥田和Lolium perenne、Poa trivilis兩個優(yōu)勢物種的單株植物。分析結(jié)果表明，BYDV-PAV和PoLV1在植物群落類型和物種中具有不同的流行模式（圖5A）。在麥田中沒有出現(xiàn)高的病毒流行率，BYDV-PAV病毒流行率僅為6%。但在非種植區(qū)域的病毒流行率較高，特別是BYDV-PAV病毒和PoLNVA病毒的共感染（高達50%的植物在草地中共感染）。不過，三種病毒的多重感染相對較少（0%-7%）（圖5B）。

圖5：（A）2018年在Anthit地點的植物群落和物種中觀察到的BYDV-PAV和兩種新物種（PoLNVA和PoLV1）的病毒流行率。

（B） 2018年在Antheit地點的非種植植物群落（草地和牧場，稱為Global）和兩種非種植禾本科植物（多年生Lolium perenne和Poa tivialis）中BYDV-PAV、PoLNVA和PoLV1的單一和多重感染百分比。

圖6：在Antheit草地（A）和牧場（B）中多年生Lolium perenne和Poa trivilis的受感染植物（BYDV-PAV、PoLNVA和PoLV1）的地理分布?；尹c和紅點分別表示未感染和感染的植物。

（4）自然草地中的大型病毒遺傳結(jié)構(gòu)

同一植物群落內(nèi)病毒序列的年際比較分析表明，許多病毒物種具有高基因組水平的遺傳穩(wěn)定性。例如在兩個采樣年份之間的Anthit牧場中，觀察到黑麥草花葉病毒（ryegrass mosaic virus，RMV）和PLNA的核苷酸同源性分別為99.4%和99.8%。然而，在Lolium潛伏病毒（Lolium latent virus，LLV；Lolavirus屬，Alphaflexiviridae科）發(fā)現(xiàn)更多變異性。對本研究中檢測到的LLV分離株的RdRp區(qū)域的共有成對同源性分析進一步證實了其遺傳多樣性。對LLV-RdRp序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖7），結(jié)果揭示了LLV的三個主要簇。在所研究2年間的同一地塊中（如AP1-C1和AP2-C5、HG1-C1和HG2-C1）、在相同地點的牧場和草地（如AG1-C3和AP1-C4、HP2-C2和HG2-C2）、在不同位點（如AG1-C2、HP2-C1和LP2-C2）、給定的圖和/或位點（如HP1-C1、LP1-C1）僅檢測一次，均檢測到密切相關(guān)的RdRp序列。此外，在同一位點中同時觀察到非常不同的RdRp序列（如AG1-C1、AG1-C2和AG1-C3），其中一些與在其他位點中鑒定的序列密切相關(guān)（如AG1-C2、HP2-C1和LP2-C2）。

圖7： 在2017（1）和2018（2）兩年間，不同地點（紅色Anthit[A]、綠色Héron[H]和藍色的Latine[L]）和群落（草地[G]和牧場[P]）的L. perenne中的LLV病毒RdRp區(qū)域共有序列（contigs de novo assembled (Cx)）系統(tǒng)發(fā)育樹（最大似然法，Tamura-Nei模型，1000個bootstraps，70%閾值）。樣品與LLV的NCBI對照比較（NC_010434）進行比較，顯示為橙色。

 

易基因小結(jié)：

本研究中使用的宏病毒組測序方法可以擴展到其他地區(qū)、不同環(huán)境梯度和氣候的更多禾本科植物物種以及其他植物科（例如茄科、豆科）。可以更廣泛地概述混合物種群落中存在的病毒群落，并有助于理解不同農(nóng)業(yè)生態(tài)的植物病毒生態(tài)學(xué)，該領(lǐng)域仍處于起步階段。

關(guān)于易基因宏病毒組測序技術(shù)介紹

病毒宏基因組學(xué)（Meta-virome）是在宏基因組學(xué)理論的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)有的病毒分子生物學(xué)檢測技術(shù)而興起的一個新的學(xué)科分支，是某類樣本中所有病毒(virus)或病毒類似物(virus-like-particle)及其所攜帶遺傳信息的總稱。宏病毒組直接以環(huán)境中所有病毒的遺傳物質(zhì)為研究對象，能夠快速準(zhǔn)確的鑒定出環(huán)境中所有的病毒組成，在病毒發(fā)現(xiàn)、病毒溯源、微生物預(yù)警等研究方面具有重要作用。宏病毒研究可應(yīng)用于人或動物腸道或者血液樣本、海洋、土壤等的研究，用以挖掘潛在的對人類和環(huán)境的危害。

 

易基因科技同丹麥哥本哈根大學(xué)知名微生物課題組聯(lián)合開發(fā)高效的宏病毒組顆粒富集方法，可對微量樣本進行病毒顆粒富集，并保證病毒活性及高均質(zhì)性，為宏病毒組學(xué)、噬菌體與細菌之間的互作關(guān)系等研究提供優(yōu)良技術(shù)支持，保駕護航！

 

技術(shù)優(yōu)勢：

?  對樣本進行病毒顆粒富集，實現(xiàn)微量樣本中的病毒組進行有效分離。

?  對噬菌體不造成損傷，最大程度保證了病毒活性，適用于下游FVT研究。

?  相較于傳統(tǒng)的PEG，CsCl等方法，均質(zhì)性高，噬菌體偏好性低。

?  全面的數(shù)據(jù)分析策略，定制的多組學(xué)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)挖掘。

 

研究方向：

宏病毒組學(xué)研究在病毒發(fā)現(xiàn)、病毒溯源、微生物預(yù)警等研究方面具有重要作用：

?  農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：環(huán)境污染、生態(tài)系統(tǒng)破壞和作物殘留化學(xué)物質(zhì)

?  生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域：調(diào)控寄主群落結(jié)構(gòu)、參與元素地球化學(xué)循環(huán)、基因水平移動媒介

?  醫(yī)藥領(lǐng)域：噬菌體和噬菌體療法的研究、人體腸道病毒組研究

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參考文獻：

Maclot F, Debue V, Malmstrom CM, Filloux D, Roumagnac P, Eck M, Tamisier L, Blouin AG, Candresse T, Massart S. Long-Term Anthropogenic Management and Associated Loss of Plant Diversity Deeply Impact Virome Richness and Composition of Poaceae Communities. Microbiol Spectr. 2023 Mar 14:e0485022.

 

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