在擬南芥中，熱休克轉錄因子A1b（HEAT SHOCK TRANSCRIPTION FACTORA1b，HSFA1b）通過影響種子產(chǎn)量來調控對環(huán)境脅迫的抗性。HSFA1b是生殖適應性的決定性因素，這種調控機制怎么形成的呢？
2018年，英國生物-植物科學類期刊Journal of Experimental Botany《實驗植物學雜志》發(fā)表了題為“Arabidopsis HEAT SHOCK TRANSCRIPTION FACTORA1b regulates multiple developmental genes under benign and stress conditions”的研究論文，通過染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等組學分析揭示了擬南芥熱休克轉錄因子A1b在調節(jié)植物高溫脅迫響應的分子機制。
標題：Arabidopsis HEAT SHOCK TRANSCRIPTION FACTORA1b regulates multiple developmental genes under benign and stress conditions 擬南芥熱休克轉錄因子A1B在良性和脅迫條件下調節(jié)多個發(fā)育基因
時間：2018-04-25
期刊：J Exp Bot
影響因子：IF 7.298
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq等
研究摘要：
本研究通過對野生型非脅迫（NS）（對照組）擬南芥與熱激（HS）（熱激組）擬南芥HSFA1b的ChIP-seq測序分析、熱激組與對照組的表達圖譜分析（RNA-seq）、蛋白結合圖譜與表達圖譜關聯(lián)分析等研究，共鑒定出952個差異表達的HSFA1b靶基因，其中至少85個與發(fā)育相關且主要在NS下結合。同時鑒定出1780個基因差異表達，但未與HSFA1b結合，其中281個具有發(fā)育相關功能。這些基因通過27個轉錄因子（TF）的分層網(wǎng)絡間接調控。此外本研究鑒定了與HSFA1b結合的480個反義RNA基因（cisNAT），揭示了進一步的間接調控模式。最后，HSFA1b靶向基因組特征不僅包含熱休克元件，還包含了MADS-box、LEAFY和G-box啟動子motif，表明HSFA1b是靶向共同應激防御和發(fā)育基因的八個轉錄因子（TF）之一。總之，本研究結果表明HSFA1b將環(huán)境線索誘導至許多應激反應和發(fā)育基因，使植物能在不同環(huán)境中不斷調整其生長和發(fā)育。
項目設計：
（1） 樣本選?。?span>
5周齡NS和HS的NP：HSFA1b和Col-0擬南芥植物的完全展開葉片樣品用于ChIP-seq和RNA-seq實驗
（2）項目設計流程圖：
研究結果：
（1）在HS條件下HSFA1b優(yōu)先結合其靶基因的上游和TSS區(qū)域
圖1：響應HS的HSFA1b結合的變化
（A）對照和熱激條件下HSFA1b結合位點富集與聚類
（B）結合位點的重疊分析
（C）三類結合位點的GO富集分析對比
（D）三類結合位點在TSS位點附近的分布
（E）三類結合位點在基因組元件上的分布
圖2：HSFA1b典型結合位點的IGV展示
（A-C）示意三類結合位點
（D-F）示意靶向反義RNA的結合位點
（2）大多數(shù)HSFA1b靶基因都對熱激敏感
圖3：RNA-seq分析三類HSFA1B靶基因的表達
（A）三類HSFA1b靶基因的差異表達分析（NS vs. HS）
（B）三類HSFA1b靶基因中上調和下調基因的GO功能富集分析
（3）過表達HSFA1b部分模擬擬南芥熱激反應
圖4：過表達HSFA1b部分模擬擬南芥熱激反應
（A）熱激蛋白（HSP）在對照組、HSFA1b過表達組和熱激組之間的表達熱圖
（B）HSFA1b過表達組和熱激組之間差異上下調基因的GO功能富集分析
（4）HSFA1b可通過調控TF表達間接調控下游靶基因表達
圖5：HSFA1b可以通過調控TF基因表達來間接調控下游靶基因表達。
（A）差異HSFA1b靶轉錄因子（TF）在對照組、HSFA1b過表達組和熱激組之間的表達熱圖
（B）RT-qPCR挑選部分把靶TF基因進行表達驗證
（C）本研究CHIP-seq鑒定的HSFA1b靶基因與擬南芥順反組圖譜數(shù)據(jù)庫（Arabidopsis Cistrome Atlas）中HSFA1b靶基因的重疊分析
（D）基于本研究CHIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)庫推導的HSFA1b分層調控網(wǎng)絡。黃色節(jié)點是HSFA1b，紅色節(jié)點是其結合的TF，藍色節(jié)點是TF調控的下游差異表達基因。
（5）HSFA1b調控反義RNA基因（cisNAT）及其靶基因的表達
圖6：HSFA1b調節(jié)順式NAT基因及其靶基因表達
（A）RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定的反義RNA及其預測靶基因的差異表達熱圖
（B）反義RNA及其預測靶基因的表達變化負相關
（C）RT-qPCR驗證反義RNA及其預測靶基因的表達
（6）HSFA1b是八種調節(jié)應激基因的轉錄因子之一
圖7：已發(fā)表的7個TFs的ChIP-seq數(shù)據(jù)表明，它們與NS和HS下的HSFA1b靶區(qū)存在顯著重疊的靶基因
（A）HSFA1b結合區(qū)域的TF motif分析；
（B）各TF-motif在HSFA1b結合區(qū)域的富集熱圖；
（C）HSFA1b和7個共定位TF的靶基因重疊分析；
（D）HSFA1b和7個共定位TF的重疊靶基因的GO富集分析
（E）由HSFA1b和多達7個其他轉錄因子結合的典型靶基因的IGV展示。
關于易基因染色質免疫共沉淀測序 (ChIP-seq)
染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究體內蛋白質與DNA相互作用的經(jīng)典方法。將ChIP與高通量測序技術相結合的ChIP-Seq技術，可在全基因組范圍對特定蛋白的DNA結合位點進行高效而準確的篩選與鑒定，為研究的深入開展打下基礎。
DNA與蛋白質的相互作用與基因的轉錄、染色質的空間構型和構象密切相關。運用組蛋白特定修飾的特異性抗體或DNA結合蛋白或轉錄因子特異性抗體富集與其結合的DNA片段，并進行純化和文庫構建，然后進行高通量測序，通過將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組精確比對，研究人員可獲得全基因組范圍內某種修飾類型的特定組蛋白或轉錄因子與基因組DNA序列之間的關系，也可對多個樣品進行差異比較。
應用方向：
ChIP 用來在空間上和時間上不同蛋白沿基因或基因組定位
? 轉錄因子和輔因子結合作用
? 復制因子和 DNA 修復蛋白
? 組蛋白修飾和變異組蛋白
技術優(yōu)勢：
? 物種范圍廣：細胞、動物組織、植物組織、細菌微生物多物種富集經(jīng)驗；
? 微量建庫：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展開測序分析；
? 方案靈活：根據(jù)不同的項目需求，選擇不同的組蛋白修飾特異性抗體。
技術路線：
有ChIP-seq測序或組學研究需要的老師可聯(lián)系易基因：0755-28317900。
參考文獻：
Albihlal WS, Obomighie I, Blein T, Persad R, Chernukhin I, Crespi M, Bechtold U, Mullineaux PM. Arabidopsis HEAT SHOCK TRANSCRIPTION FACTORA1b regulates multiple developmental genes under benign and stress conditions. J Exp Bot. 2018 May 19;69(11):2847-2862.
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