選取行腹腔鏡膀胱根治術(shù)（LRC）、膀胱部分切除術(shù)（PC）或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（TURBT）的膀胱癌患者組織樣本，采集膀胱腫瘤組織和癌旁組織。手術(shù)后立即用無菌生理鹽水清潔組織，并儲(chǔ)存在-80°C以進(jìn)行檢測。共采集45例患者膀胱組織標(biāo)本45份，其中膀胱癌組織45份，癌旁組織18份。

（2）項(xiàng)目設(shè)計(jì)流程圖：

結(jié)果圖形

圖1：單堿基分辨率對(duì)膀胱癌樣品進(jìn)行5mC和5hmC分析。

（A） 在膀胱癌樣品中鑒定出的顯著5mC和5hmC DMR數(shù)量。

（B） 5mC和5hmC DMR的基因組注釋。

膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。

膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。

圖2：復(fù)發(fā)性膀胱癌的5mC和5hmC分析。

（A） 在復(fù)發(fā)性膀胱癌樣品中鑒定出的5mC和5hmC DMR的數(shù)量（左），5mC和5hmC DMR的基因組注釋（右）。

（B） RNA-seq用5hmC DMR標(biāo)準(zhǔn)化脂肪酸代謝相關(guān)基因數(shù)量。

（C） 對(duì)TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特異性qPCR驗(yàn)證。

（D和E）復(fù)發(fā)性膀胱癌中的差異甲基化譜與組織收集后發(fā)生復(fù)發(fā)性UBC的5名患者之間的相關(guān)性。

圖3：PD-L1高表達(dá)膀胱癌癥的甲基化變化。

（A） PD-L1高表達(dá)膀胱癌癥樣本中鑒定的5mC和5hmC DMR數(shù)量（左），5mC和5hmC DMRs的基因組注釋（右）。

（B） PD-L1高表達(dá)膀胱癌癥樣本中5mC DMR生物標(biāo)記物的甲基化變化熱圖。

（C） PD-L1高表達(dá)膀胱癌中差異性5hmC水平和差異性5mC水平之間的相關(guān)性散點(diǎn)圖。

圖4：利用5mC生物標(biāo)志物預(yù)測免疫治療反應(yīng)。

（A） TET基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化水平變化。

（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化預(yù)測PD-L1高表達(dá)的膀胱癌AUC評(píng)分。

（C） 注釋到NFATC1的5mC DMR軌跡圖（左），預(yù)測PD-L1高表達(dá)膀胱癌的一種NFATC1-DMR預(yù)測AUC評(píng)分（右）。

總結(jié)：

本研究采用改進(jìn)的全基因組DNA甲基化和DNA羥甲基化圖譜繪制方法，將氧化還原代表性亞硫酸鹽測序（oxRRBS）與傳統(tǒng)RRBS相結(jié)合。oxRRBS可以實(shí)現(xiàn)5hmC至fC的選擇性氧化。羥甲基化水平可以通過從RRBS中減去從oxRRBS獲得的亞硫酸鹽測序信號(hào)來確定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分別計(jì)算精確的5mC和5hmC水平，從而以更高的分辨率提供更詳細(xì)的表觀遺傳學(xué)信息，更適合用作膀胱癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

關(guān)于易基因精準(zhǔn)DNA甲基化/羥甲基化測序（oxBS-seq）

羥甲基化5hmC是哺乳動(dòng)物基因組上的第六堿基，在發(fā)育、衰老、神經(jīng)退行性疾病、復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點(diǎn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)之前被認(rèn)為是檢測DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)的重亞硫酸鹽測序并不能區(qū)分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。

易基因聯(lián)合劍橋大學(xué)建立了化學(xué)氧化法結(jié)合重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的測序技術(shù)（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術(shù)不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結(jié)合同時(shí)單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。

傳統(tǒng)BS轉(zhuǎn)化無法區(qū)分5mC和5hmC

傳統(tǒng)的Bisulfite測序中，5hmC經(jīng)過Bisulfite處理后變?yōu)?span>CMS，CMS在測序中仍然被讀作C堿基，因此不能區(qū)分5mC和5hmC。

oxBS技術(shù)原理

技術(shù)優(yōu)勢：

• ?  DNA甲基化檢測全新的“標(biāo)準(zhǔn)”；
• ?  單堿基檢測DNA羥甲基化修飾；
• ?  多重質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)檢測氧化效率和Bisulfite轉(zhuǎn)換率；
• ?  實(shí)驗(yàn)偏好性低，重復(fù)性高（R2＞0.98）；
• ?  易基因自主研發(fā)的甲基化特異性多重PCR引物設(shè)計(jì)軟件；
• ?  可滿足多種測序應(yīng)用需求：
• l  全基因組氧化甲基化測序（oxWGBS）
• l  簡化基因組氧化甲基化測序（oxRRBS）
• l  目標(biāo)區(qū)域靶基因氧化甲基化測序（Target-oxBS）。

技術(shù)路線：

技術(shù)指標(biāo)：

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，技術(shù)詳情請(qǐng)致電易基因0755-28317900。

參考文獻(xiàn)：

Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.