松木線蟲（PWN，Bursaphelenchus xylophilus）是一種破壞性病原體，可引起松樹枯萎病，感染PWN的松樹最終會(huì)死亡。這種微觀線蟲具有復(fù)雜的生命周期，具有植食性（以植物為食）和菌絲體（以真菌為食）的發(fā)育階段，以及不同的生命周期，包括繁殖和擴(kuò)散周期（圖1A）。在通過載體昆蟲（Monochamus spp.）傳播到活樹中后，PWN最初以皮層和木質(zhì)部周圍的上皮細(xì)胞為食，然后主要通過樹脂管（植食性階段）在樹內(nèi)遷移。隨著樹木開始出現(xiàn)枯萎和其他癥狀的跡象，PWN開始以樹內(nèi)存在的真菌（噬菌體）為食。在此過程中，PWN從卵孵化到三個(gè)繁殖幼體階段（J2、J3和J4）經(jīng)歷一個(gè)繁殖周期，最終發(fā)育成成蟲。當(dāng)秋天到來時(shí)，不利的生活條件，如低溫、干燥和食物短缺開始出現(xiàn)，引發(fā)PWN繁殖周期停止，第二階段繁殖幼體（J2）逐漸發(fā)展為第三階段擴(kuò)散幼體（JIII）。JIII階段能夠承受不利的外部條件，在媒介昆蟲的影響下，Monochamus beetles在第二年春天轉(zhuǎn)化為第四階段擴(kuò)散幼體（JIV）。當(dāng)Monochamus beetles出現(xiàn)并以健康的松樹為食時(shí)，JIV階段被轉(zhuǎn)移到樹上。在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，JIV在松樹內(nèi)轉(zhuǎn)化并發(fā)育成成蟲，從而進(jìn)入生殖周期。JIII階段是其生命周期中的一個(gè)關(guān)鍵階段，這個(gè)階段的線蟲具有感染宿主樹木的能力。研究這一階段形成過程中的DNA甲基化差異，可以幫助科學(xué)家們理解松材線蟲如何調(diào)控其基因表達(dá)以適應(yīng)不同的生命周期階段，特別是與感染和致病能力相關(guān)的基因。

圖1：松材線蟲的生命周期和被測線蟲形態(tài)。

A. PWN的繁殖周期和擴(kuò)散周期。J2：第二階段繁殖幼體；J3： 第三階段繁殖幼體；J4：第四階段繁殖幼體；JIII：第三階段擴(kuò)散幼體；JIV：第四階段擴(kuò)散幼體。

B. 本實(shí)驗(yàn)使用了不同發(fā)育階段的PWN?？潭戎甘?span> 100 μm。

 

2023年11月30日，中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所王鵬等為第一作者、理永霞研究員為通訊作者在《Curr. Issues Mol. Biol》雜志發(fā)表題為“Analysis of DNA Methylation Differences during the JIII Formation of Bursaphelenchus xylophilus”的研究論文，研究全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），比較JIII階段與其它階段的DNA甲基化模式，揭示了DNA甲基化在PWN環(huán)境適應(yīng)中的調(diào)控作用。易基因科技為本研究提供WGBS和RNA-seq建庫測序分析技術(shù)服務(wù)。

研究摘要：

DNA甲基化是調(diào)控基因表達(dá)并促進(jìn)生物體快速適應(yīng)挑戰(zhàn)性環(huán)境的關(guān)鍵過程。松材線蟲（PWN；Bursaphelenchus xylophilus）是松材線蟲病的病原體，通過第三階段擴(kuò)散幼體(JIII)在低溫下存活，使其成為亞洲松樹的主要病原體。為了了解DNA甲基化對(duì)第三階段擴(kuò)散幼體形成和環(huán)境適應(yīng)的影響，研究對(duì)PWN的第三階段擴(kuò)散幼體和其他三個(gè)繁殖幼體階段進(jìn)行了全基因組亞硫酸鹽測序和轉(zhuǎn)錄組測序。研究結(jié)果表明，樣品中胞嘧啶的平均甲基化率在0.89%~0.99%之間。在PWN的第三階段擴(kuò)散幼體和第二階段繁殖幼體中DNA甲基化發(fā)生顯著變化，包括差異甲基化胞嘧啶（DMCs，n=435）和區(qū)域（DMR，n=72）。在甲基化相關(guān)轉(zhuǎn)錄聯(lián)合分析中，23個(gè)基因在PWN第三階段擴(kuò)散幼體的形成過程中表現(xiàn)出差異甲基化區(qū)域和差異基因表達(dá)之間存在重疊。對(duì)這些基因的進(jìn)一步功能分析表明，它們?cè)谂c脂質(zhì)代謝和脂肪酸合成有關(guān)的過程中富集。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了DNA甲基化在PWN第三階段擴(kuò)散幼體發(fā)育中的重要性，因?yàn)樗ㄟ^調(diào)控轉(zhuǎn)錄以提高PWN快速傳播的可能性。

 

研究結(jié)果：

（1）胞嘧啶甲基化的分布和統(tǒng)計(jì)

圖2：全基因組DNA甲基化模式。

A. 松材線蟲11個(gè)支架的全基因組甲基化圖譜。（?）mC水平。（?）基因密度。（?）mC密度。

B. 四個(gè)生命階段的平均甲基化水平。

C. 四個(gè)生命階段的PCA分析。

 

（2）DMC和DMR的鑒定和分析

圖3：在松材線蟲的四個(gè)不同發(fā)育階段，DMC和DMR的全基因組分布。

A. 在三個(gè)成對(duì)比較中，對(duì)高甲基化和低甲基化DMC的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)并分布在染色體和基因元件上：JIII與J2，JIII與J3，JIII與J4。染色體以及外顯子和啟動(dòng)子的分布分別顯示在左欄和右欄中。

B. 計(jì)算高甲基化和低甲基化DMR的數(shù)量，并將其分布在染色體和基因元件上。

 

（3）JIII形成過程中DMR的GO分析

圖4：DMR中DMG的GO富集結(jié)果。

A. 相對(duì)于對(duì)照組（松材線蟲JIII與J2），實(shí)驗(yàn)組中由高甲基化DMR修飾的基因的功能富集分析。

B. JIII與J2中低甲基化DMR修飾的基因的富集。y軸表示通路名稱，x軸表示富集因子，氣泡大小表示每個(gè)通路中的基因數(shù)量。該圖僅顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的條目（rawP<0.05）。如果每種類型有超過10條顯著富集通路，則僅顯示每種類型的前10條通路結(jié)果。GO分為三個(gè)本體，即：分子功能（MF），細(xì)胞成分（CC）和生物過程（BP）。

 

（4）轉(zhuǎn)錄組分析和通路富集總結(jié)

圖5：松材線蟲JIII形成過程中的RNA-seq測序分析。

A. JIII與J2中差異表達(dá)基因（DEG）的火山圖。紅點(diǎn)和綠點(diǎn)表示顯著上調(diào)和下調(diào)的差異基因，黑點(diǎn)表示不顯著差異基因。

B. JIII與J2中DEG的熱圖。紅色表示上調(diào)的基因，紫色表示下調(diào)的基因。

C. JIII與J2中DEG的GO富集。GO分為三個(gè)本體，即：分子功能（MF），細(xì)胞成分（CC）和生物過程（BP）。

D. JIII與J2中DEG的KEGG通路富集。點(diǎn)的大小代表富集到條目的基因總數(shù)，較小的p.adjust值由更紅色表示。

 

（5）JIII形成過程中DMRs與基因表達(dá)的相關(guān)性分析

圖6：松材線蟲JIII與J2中低甲基化和轉(zhuǎn)錄變化基因的GO富集分析。

A. GO富集基因體中的甲基化基因，而轉(zhuǎn)錄減少。

B. GO富集基因體中甲基化基因，同時(shí)轉(zhuǎn)錄升高。

C. GO富集啟動(dòng)子中甲基化基因，而轉(zhuǎn)錄減少。

D. GO富集啟動(dòng)子中甲基化基因，同時(shí)轉(zhuǎn)錄升高。

 

（6）DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組的驗(yàn)證

圖7：使用RT-qPCR驗(yàn)證RNA-seq和DNA甲基化。

A. 選定DNA片段的DNA甲基化驗(yàn)證。

B. RNA-Seq結(jié)果中的RT-qPCR驗(yàn)證。

 

研究小結(jié)

本研究首次在松材線蟲（PWN）全基因組范圍內(nèi)繪制了DNA甲基化水平的分布情況，證實(shí)了線蟲在四個(gè)發(fā)育階段中均存在DNA甲基化。在擴(kuò)散性JIII階段與繁殖性階段之間，甲基化存在顯著差異，表明DNA甲基化可能在JIII階段抗不利環(huán)境條件中發(fā)揮潛在作用。研究還支持DNA甲基化在JIII形成過程中相關(guān)基因調(diào)控中的參與。在低甲基化區(qū)域高表達(dá)的基因可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝通路，促進(jìn)JIII階段的形成和環(huán)境適應(yīng)性。此外在JIII形成過程中，Enr和Pex10基因甲基化水平下調(diào)可以促進(jìn)這些基因表達(dá)。又增強(qiáng)JIII在脂肪酸合成和脂質(zhì)平衡維持中的參與度，使其能夠在不利環(huán)境中生存。本研究為理解PWN快速擴(kuò)張的機(jī)制提供了新的見解，并為松材線蟲枯萎病的預(yù)防和控制奠定了理論基礎(chǔ)。然而，需要進(jìn)一步研究來闡明DNA甲基化的調(diào)控機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Wang P, Li Y, Liu Z, Zhang W, Li D, Wang X, Wen X, Feng Y, Zhang X. Analysis of DNA Methylation Differences during the JIII Formation of Bursaphelenchus xylophilus. Curr Issues Mol Biol. 2023 Nov 30;45(12):9656-9673. pii: cimb45120603. doi: 10.3390/cimb45120603. PubMed PMID: 38132449.

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