表觀遺傳修飾在多種生物和病理過程中起著關鍵作用，其中5-甲基胞嘧啶（5mC）被認為是腫瘤發(fā)生和進展的早期分子事件，并已成為一個非常有前景的生物標志物。近年來，5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）作為5mC的氧化產(chǎn)物，在正常哺乳動物生長和發(fā)育中也扮演著重要角色，并與癌癥和神經(jīng)疾病等疾病相關，顯示出作為癌癥診斷理想生物標志物的巨大潛力。然而，由于5hmC水平比5mC低約14倍，且其結構與C和5mC相似，使得5hmC的定量檢測更具挑戰(zhàn)性。

近日，上海交通大學生物醫(yī)學工程學院彭小喚博士為第一作者、徐宏研究員為通訊作者在《Analytical Chemistry》期刊發(fā)表題為“Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability”的科研成果，研究建立了一種名為EDD-5hmC的5hmC定量方法，該方法通過結合酶切（Enzymatic Digestion）和生物脫氨（Deamination）策略，利用qPCR平臺實現(xiàn)對片段特異性DNA序列中5hmC的極高特異性、高靈敏度和臨床適用性的定量分析。該方法首次在結直腸癌組織和配對的癌旁組織中檢測了5hmC水平，以評估其區(qū)分結直腸癌的能力，結果顯示單基因Septin9的ROC曲線下面積高達82.8%，Septin9和Syndecan-2（SDC2）組合的ROC曲線下面積為83.6%，表明EDD-5hmC方法是一種具有臨床應用前景的準確定量5hmC水平的方法。深圳易基因科技為本研究提供靶基因DNA羥甲基化檢測（AmpACE-seq）技術服務。

標題：Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability（通過結合酶切和脫氨作用的qPCR對5hmC片段特異性定量檢測：極高特異性、高靈敏度和臨床適用性）

準確鑒定和定量5hmC有助于闡明其在基因表達和疾病發(fā)病機制中的功能，目前的5hmC分析方法在臨床應用中，存在假陽性結果的風險以及靈敏度不足的問題。本研究建立了一種靶向片段特異性DNA序列的5hmC定量方法，該方法具有極高的特異性、高靈敏度和臨床適用性——EDD-5hmC檢測法，該方法通過酶切富集糖基化的5hmC，然后利用APOBEC（載脂蛋白B mRNA編輯催化多肽樣）介導的脫氨基作用，有效區(qū)分各種胞嘧啶（C）修飾狀態(tài)，實現(xiàn)了極高特異性的5hmC定量，使非特異性擴增減少8M倍。此外，EDD-5hmC檢測法的非破壞性生物處理過程表現(xiàn)出高靈敏度，最低檢出限(Limit of Detection,LOD)達到30 aM。研究人員利用該方法首次檢測了結直腸癌組織和匹配的癌旁組織中的5hmC水平，以評估其區(qū)分結直腸癌的能力，單基因Septin9的受試者工作特征曲線下面積高達82.8%，Septin9和Syndecan-2（SDC2）組合的曲線下面積為83.6%，表明EDD-5hmC檢測法是一種具有臨床應用前景的準確定量5hmC水平的方法。