表觀遺傳調(diào)控，包括DNA甲基化、RNA修飾和染色質(zhì)重塑等，在神經(jīng)退行性疾病中起重要作用。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）是一種已知的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，主要負(fù)責(zé)維持DNA甲基化。然而DNMT1在非分裂細(xì)胞中的功能尚不清楚。此外，DNMT1的RFTS（replication focus targeting sequence ）結(jié)構(gòu)域突變（如A560V）與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，但其分子機(jī)制尚未完全闡明。

 

近日，美國加州大學(xué)洛杉磯分校終身教授/上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所特聘教授范國平課題組揭示了 DNMT1在調(diào)控DNA和RNA甲基化中的雙重作用，特別是其通過RNA修飾調(diào)控線粒體功能的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1能夠與mRNA結(jié)合并促進(jìn)其穩(wěn)定性，并通過招募NSUN2蛋白來調(diào)節(jié)RNA的5-甲基胞嘧啶（m⁵C）甲基化。此外，研究還發(fā)現(xiàn)DNMT1的RFTS結(jié)構(gòu)域突變（如A560V）會(huì)導(dǎo)致代謝基因的RNA甲基化和穩(wěn)定性異常，進(jìn)而引發(fā)線粒體功能障礙和神經(jīng)退行性疾病。這些發(fā)現(xiàn)為理解DNMT1在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用提供了新的視角，并為開發(fā)靶向RNA甲基化的治療策略提供了理論基礎(chǔ)。相關(guān)研究成果以《DNA methyltransferase 1 modulates mitochondrial function through bridging m⁵C RNA methylation》為題發(fā)表于《Molecular Cell》期刊。易基因科技為本研究提供m⁵C甲基化測序RNA-BS-seq技術(shù)服務(wù)。

文章標(biāo)題：DNA methyltransferase 1 modulates mitochondrial function through bridging m⁵C RNA methylation

發(fā)表時(shí)間：2025-05-05

發(fā)表期刊：Molecular Cell

影響因子：IF14.5/Q1

技術(shù)平臺(tái)： RNA-BS-seq、RRBS、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）

DNMT1是一種維持DNA甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。其復(fù)制焦點(diǎn)靶向序列（RFTS）結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致晚發(fā)性神經(jīng)退行性疾病，如常染色體顯性小腦性共濟(jì)失調(diào)-耳聾和嗜睡癥（ADCA-DN）疾病。本研究首先驗(yàn)證了DNMT1具有結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄本的功能，并通過招募NOP2/Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶2（NSUN2）來促進(jìn)RNA m⁵C甲基化。同時(shí)，RNA m⁵C甲基化增強(qiáng)那些調(diào)節(jié)線粒體功能基因的RNA穩(wěn)定性。當(dāng)小鼠的DNMT1 RFTS結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變時(shí)，會(huì)引發(fā)異常的DNMT1-RNA相互作用，并顯著提高部分代謝基因的m⁵C RNA甲基化和RNA穩(wěn)定性。因此，代謝RNA轉(zhuǎn)錄本水平增加導(dǎo)致了累積性的氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和神經(jīng)癥狀?？傮w而言，本研究結(jié)果揭示了DNMT1在調(diào)節(jié)DNA和RNA甲基化中的雙重作用，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)了線粒體功能，為DNMT1突變誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新見解。

圖形摘要

 

研究方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和基因編輯

細(xì)胞培養(yǎng)：使用HeLa細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞以及小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs），并在特定條件下培養(yǎng)。

基因編輯：通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了攜帶Dnmt1^A560V突變的小鼠模型和細(xì)胞系。

2、動(dòng)物模型和行為學(xué)測試

小鼠模型：構(gòu)建Dnmt1^A560V突變小鼠模型，用于研究DNMT1突變對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的長期影響。

行為學(xué)測試：包括后肢抓握測試和旋轉(zhuǎn)桿測試，評(píng)估小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙。

3. RNA結(jié)合蛋白分析

增強(qiáng)型交聯(lián)免疫沉淀測序（eCLIP-seq）：鑒定DNMT1結(jié)合的mRNA轉(zhuǎn)錄本（DNMT1-bound mRNA transcripts，DBTs），發(fā)現(xiàn)DNMT1能夠結(jié)合大量mRNA，并影響其穩(wěn)定性。

4. RNA甲基化分析

RNA-BS-seq：分析RNA m⁵C甲基化水平，發(fā)現(xiàn)DNMT1能夠通過招募NSUN2蛋白來調(diào)節(jié)RNA的m⁵C甲基化。

質(zhì)譜分析（UHPLC-MRM-MS/MS）：定量分析RNA甲基化水平，驗(yàn)證DNMT1對(duì)m⁵C甲基化的調(diào)控作用。

5. 蛋白質(zhì)互作分析

Co-IP：檢測DNMT1與NSUN2互作，并通過質(zhì)譜分析鑒定DNMT1的互作蛋白。

等溫滴定量熱法（ITC）：檢測DNMT1與NSUN2之間的結(jié)合親和力。

6. 基因表達(dá)和表觀遺傳分析

RNA-seq：分析基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Dnmt1^A560V突變導(dǎo)致代謝基因表達(dá)失調(diào)。

DNA甲基化測序（EM-seq和RRBS）：分析DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)突變對(duì)DNA甲基化影響較小，但對(duì)RNA甲基化影響顯著。

7. 單細(xì)胞分析

scRNA-seq和snRNA-seq：分析神經(jīng)組織中不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)變化，揭示了廣泛的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

8. 代謝和線粒體功能分析

細(xì)胞能量代謝分析：評(píng)估細(xì)胞的氧氣消耗率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）。

線粒體DNA含量測定：通過qPCR分析線粒體DNA含量。

氧化應(yīng)激和ATP含量分析：檢測細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和ATP水平。

 

結(jié)果圖形

（1）DNMT1直接與mRNA結(jié)合以增強(qiáng)其穩(wěn)定性

DNMT1能夠與mRNA結(jié)合，并通過增強(qiáng)RNA穩(wěn)定性以調(diào)控基因表達(dá)。通過eCLIP-seq技術(shù)，研究者在HeLa細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中鑒定出大量DBTs，這些轉(zhuǎn)錄本主要分布在5’UTR區(qū)域。DNMT1的結(jié)合顯著增強(qiáng)了這些mRNA的穩(wěn)定性，且這種穩(wěn)定性與RNA的細(xì)胞核質(zhì)比和翻譯效率相關(guān)。

圖1：DNMT1與參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的部分mRNA結(jié)合

 

（2）DNMT1通過招募NSUN2調(diào)控DBTs的m⁵C RNA甲基化

DNMT1能夠通過招募NSUN2蛋白來調(diào)節(jié)RNA m⁵C甲基化。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析，研究者發(fā)現(xiàn)DNMT1與NSUN2之間存在直接相互作用，且這種相互作用部分依賴于RNA。RNA-BS-seq分析顯示，DNMT1敲低（KD）的細(xì)胞中m⁵C水平顯著降低，且這些位點(diǎn)與DBTs高度重疊。

圖2：DNMT1對(duì)mRNA上m⁵C RNA甲基化的調(diào)控

(A) 鑒定DNMT1相互作用蛋白的FLAG免疫沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)方案，隨后進(jìn)行質(zhì)譜（MS）分析。

(B) 在IP-MS實(shí)驗(yàn)中，通過質(zhì)譜檢測到的DNMT1相互作用肽段與非特異性肽段（僅EGFP）的豐度差異。

(C) 在HeLa細(xì)胞中異位表達(dá)全長NSUN2和FLAG標(biāo)簽的DNMT1。隨后使用抗FLAG抗體進(jìn)行染色質(zhì)裂解液的IP。然后用抗NSUN2和抗DNMT1抗體對(duì)IP蛋白進(jìn)行免疫檢測。

(D) DNMT1結(jié)構(gòu)域和FLAG-DNMT1分離片段（F1–F4）的示意圖。

(E) 共免疫沉淀檢測FLAG-DNMT1分離片段（F1–F4）與NSUN2的相互作用。

(F) RNA-BS-seq熱圖顯示在HeLa細(xì)胞中鑒定出的依賴DNMT1的m⁵C位點(diǎn)。

(G) DBTs與含有DNMT1依賴性m⁵C位點(diǎn)的基因之間的重疊。

(H) 由于DNMT1敲低（KD）處理而在HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定性發(fā)生變化的轉(zhuǎn)錄本的鑒定。

(I) DBTs與因DNMT1 KD而RNA穩(wěn)定性降低的基因之間的重疊。

(J) 對(duì)照組（Ctrl）和DNMT1 KD HeLa細(xì)胞中DBTs（左側(cè)）和非DBTs（右側(cè)）的RNA穩(wěn)定性條形圖。

(K) 對(duì)照組（Ctrl）和DNMT1 KD HeLa細(xì)胞中所有DBTs的RNA穩(wěn)定性總結(jié)。

(L) 對(duì)含有DNMT1依賴性m⁵C位點(diǎn)的DBTs進(jìn)行GO分析。

(M) 基因組軌跡顯示在對(duì)照組和DNMT1 KD HeLa細(xì)胞中Slam-seq信號(hào)在SPG7上的分布。

 

（3）Dnmt1^A560V突變小鼠出現(xiàn)代謝和神經(jīng)系統(tǒng)疾病

Dnmt1^A560V突變小鼠表現(xiàn)出多種代謝和神經(jīng)癥狀，包括體重下降、運(yùn)動(dòng)功能障礙和氧化應(yīng)激增加。這些癥狀與線粒體功能障礙相關(guān)，且在突變小鼠的多個(gè)組織中觀察到代謝基因的RNA甲基化和穩(wěn)定性顯著增加。

圖3：Dnmt1^A560V小鼠表現(xiàn)出代謝和神經(jīng)紊亂

(A) Dnmt1結(jié)構(gòu)域示意圖及ADCA-DN A560V突變的位置。

(B) 部分純合突變（Hom）小鼠表現(xiàn)出圓頂狀頭顱的腦積水（上）。整體大腦顯示出擴(kuò)大的大腦半球、受壓的嗅球和下陷的大腦皮層（下）。

(C) 代表性大腦矢狀面（上）和冠狀面（下）切片顯示，與野生型（WT）小鼠相比，Hom突變小鼠的側(cè)腦室（LVs）極度擴(kuò)張，且大腦皮層變薄。

(D) 本研究中鑒定出的WT、Het和Hom小鼠的總數(shù)和腦積水小鼠的數(shù)量。

(E-F) 雄性小鼠（每種基因型n=20）（E）和磁性小鼠（每種基因型n=20）（F）的生長曲線。

(G) 本研究中三種基因型的白內(nèi)障發(fā)病率。

(H-I) 三種基因型小鼠的后肢抓握評(píng)分，雄性（H）和雌性（I）。

(J-K) 6個(gè)月大雄性（J）和雌性（K）小鼠的旋轉(zhuǎn)桿性能測試。

 

（4）Dnmt1^A560V突變顯著增加代謝mRNA轉(zhuǎn)錄本水平

在Dnmt1^A560V突變小鼠細(xì)胞中，代謝基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本水平顯著增加。這些轉(zhuǎn)錄本的增加與RNA m⁵C甲基化水平升高相關(guān)，表明DNMT1突變增強(qiáng)了RNA甲基化和穩(wěn)定性。

圖4：Dnmt1點(diǎn)突變導(dǎo)致部分代謝基因的轉(zhuǎn)錄去抑制

(A) hDNMT1蛋白對(duì)DNA的甲基轉(zhuǎn)移酶活性的發(fā)光檢測。

(B) 不同小鼠組織中基因體的平均甲基化水平。CB，小腦；Cor，皮層；M，月齡。

(C) 不同樣本中高甲基化和低甲基化DMRs比例。

(D) 最接近DMRs基因與DBTs的重疊。

(E) 皮層中與DBT相關(guān)的DMRs數(shù)量的餅圖。

(F) 皮層中與DBT相關(guān)的DMRs的甲基化差異（左）和相應(yīng)的基因表達(dá)變化倍數(shù)（右）。

(G) 鑒定皮層中的差異表達(dá)基因（DEGs）。

(H) 所有與DBT相關(guān)的DEGs的相對(duì)表達(dá)（左）和皮層中相應(yīng)TSS±2 kb區(qū)域的甲基化水平（右）。

(I) 對(duì)皮層中與DBT相關(guān)的DEGs的TSS±2kb區(qū)域中，純合子（Hom）與野生型（WT）之間的DNA甲基化變化比例分析。

參考文獻(xiàn)：

Wang et al., DNA methyltransferase 1 modulates mitochondrial function through bridging m⁵C RNA methylation,Molecular Cell (2025), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.04.019