人類呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是引起嬰幼兒和老年人呼吸道感染的常見(jiàn)病原體，目前尚無(wú)特效藥物。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA上最常見(jiàn)的修飾之一，參與多種細(xì)胞過(guò)程和病理過(guò)程的調(diào)控，包括病毒感染。研究表明，m6A修飾在病毒感染過(guò)程中發(fā)生變化，可能影響宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。

 

近日，遵義市第一人民醫(yī)院（遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院）呼吸內(nèi)科李竹博士等為第一作者，貴州省人民醫(yī)院劉代順教授為通訊作者，在《iScience》雜志發(fā)表題為《The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus》的研究論文，探討了m6A修飾在人類呼吸道合胞病毒（RSV）感染中的作用，特別是FTO（脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)蛋白）和GDF6（生長(zhǎng)分化因子6）在調(diào)控宿主抗病毒免疫和炎癥反應(yīng)中的功能。研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染導(dǎo)致宿主m6A修飾水平下降，FTO表達(dá)增加，而FTO通過(guò)調(diào)控GDF6的m6A修飾影響病毒復(fù)制和免疫反應(yīng)。研究結(jié)果為開發(fā)靶向RSV感染的新療法提供了潛在的分子靶點(diǎn)。易基因?yàn)楸狙芯刻峁┧璧?span>m6A MeRIP-seq測(cè)序分析技術(shù)服務(wù)。

標(biāo)題：The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus（GDF6-FTO軸調(diào)控對(duì)人類呼吸道合胞病毒的先天免疫和炎癥反應(yīng)）

發(fā)表時(shí)間：2024年10月18日

發(fā)表期刊：iScience

影響因子：IF5.8

技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq（易基因金牌技術(shù)）

研究亮點(diǎn)

l  RSV感染促進(jìn)去甲基化酶FTO增加：RSV感染導(dǎo)致去甲基化酶FTO的表達(dá)水平上升。

l  FTO耗竭穩(wěn)定了GDF6的mRNA：在FTO基因敲除的細(xì)胞中，GDF6的mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)。

l  結(jié)合蛋白IGF2BP1缺失導(dǎo)致GDF6表達(dá)下降：IGF2BP1（胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白1）的缺乏會(huì)降低GDF6的表達(dá)水平。

l  FTO/GDF6軸改變I型干擾素和促炎因子：FTO和GDF6互作可調(diào)控I型干擾素和促炎細(xì)胞因子水平。

 

研究摘要

本研究通過(guò)MeRIP-seq和對(duì)應(yīng)的RNA-seq分析，揭示了去甲基化酶FTO（脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)蛋白）耗竭能夠穩(wěn)定GDF6的mRNA，增強(qiáng)I型干擾素（I-IFN）水平，并降低促炎因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。此外結(jié)合蛋白IGF2BP1缺失會(huì)導(dǎo)致GDF6表達(dá)下降，進(jìn)而減少I型干擾素產(chǎn)生。并進(jìn)一步證實(shí)了RSV感染患者咽拭子樣本中m6A水平的變化?？傊狙芯拷Y(jié)果表明，RSV感染能夠誘導(dǎo)宿主m6A修飾水平變化，而FTO介導(dǎo)的m6A修飾通過(guò)促進(jìn)GDF6 mRNA的穩(wěn)定性和蛋白翻譯，確保了抗病毒免疫反應(yīng)進(jìn)行。

FTO-GDF6軸、m6A修飾、抗病毒免疫和病毒復(fù)制之間關(guān)系機(jī)制圖形摘要

 

 

研究方法

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：使用BEAS-2B（人支氣管上皮細(xì)胞）進(jìn)行RSV感染實(shí)驗(yàn)。

臨床樣本分析：收集RSV感染兒童的咽拭子樣本，檢測(cè)m6A修飾水平。

基因敲除和過(guò)表達(dá)：通過(guò)慢病毒載體構(gòu)建FTO敲除和GDF6過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型。

m6A檢測(cè)：使用m6A比色法、質(zhì)譜（MS）分析、RNA斑點(diǎn)印跡等方法檢測(cè)m6A修飾水平。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）和m6A免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）：分析RSV感染后m6A修飾的基因變化。

Western Blot：檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

小鼠模型：通過(guò)小鼠模型驗(yàn)證RSV感染的病理變化和FTO、GDF6的功能及qPCR驗(yàn)證。

 

結(jié)果圖形

（1）RSV感染與低水平m6A mRNA甲基化相關(guān)

RSV感染后，BEAS-2B細(xì)胞和兒童咽拭子樣本中的m6A修飾水平顯著下降，且這種下降與FTO表達(dá)增加相關(guān)。這表明FTO可能在RSV感染過(guò)程中起主要作用。

圖1：RSV感染期間m6A表達(dá)下調(diào)，與FTO水平升高一致。

(A) m6A比色法檢測(cè)BEAS-2B細(xì)胞在RSV感染24h后的mRNA m6A修飾整體水平。

(B) m6A比色法檢測(cè)BEAS-2B細(xì)胞在400TCID50/mL RSV感染后不同時(shí)間點(diǎn)的m6A水平。

(C) LC-MS量分析BEAS-2B細(xì)胞在400TCID50/mL RSV感染24h后的m6A豐度。

(D) m6A比色法定量分析咽拭子樣本中總RNA的m6A含量（每組n=16）。

(E) RSV感染24h后BEAS-2B細(xì)胞RNA水平的斑點(diǎn)印跡分析。

(F) qPCR分析BEAS-2B細(xì)胞在RSV感染24h后的m6A調(diào)控因子表達(dá)。

(G) GSE3397數(shù)據(jù)集的m6A調(diào)控因子熱圖。

(H-J) Western blot分析BEAS-2B細(xì)胞在RSV感染后RSV-F和FTO的蛋白表達(dá)。

(K) qPCR分析咽拭子樣本中FTO的表達(dá)。

(L) m6A修飾與FTO表達(dá)之間的相關(guān)性分析。

 

（2）RSV感染抑制細(xì)胞增殖，激活先天免疫，并促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子釋放

RSV感染抑制了BEAS-2B細(xì)胞的增殖，并顯著增加了炎癥細(xì)胞因子（如IL-1、IL-6）和I型干擾素（IFN-α、IFN-β）的表達(dá)，激活了宿主的先天免疫反應(yīng)。

圖2：RSV感染抑制細(xì)胞增殖，激活先天免疫，并促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子釋放

(A) 在RSV感染后不同時(shí)間點(diǎn)，TCID50法檢測(cè)HEp-2細(xì)胞中的RSV病毒滴度。

(B) 在RSV感染后不同時(shí)間點(diǎn)，CCK-8實(shí)驗(yàn)分析BEAS-2B細(xì)胞的增殖情況。

(C-H) RSV感染24小時(shí)后BEAS-2B細(xì)胞的qPCR分析。

(I-O) RSV感染24小時(shí)后BEAS-2B細(xì)胞中RSV-G、TLR7、MyD88、RIG-I和IL-6蛋白水平的Western blot分析。

 

（3）體外實(shí)驗(yàn)中FTO對(duì)抗病毒免疫是必需的

FTO基因敲除的BEAS-2B細(xì)胞中，I型干擾素和抗病毒基因的表達(dá)顯著增加，而炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)減少，表明FTO在調(diào)節(jié)抗病毒免疫中起關(guān)鍵作用。

圖3：體外實(shí)驗(yàn)中FTO對(duì)抗病毒免疫是必需的。

(A) 使用慢病毒載體建立FTO基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系。

(B-C) 對(duì)照組和FTO基因敲除BEAS-2B細(xì)胞的RNA-seq結(jié)果進(jìn)行GO和KEGG分析。

(D) FTO基因敲除組TNF信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)錄特征的雙尾基因集富集分析。

(F) 炎癥細(xì)胞因子和干擾素相關(guān)基因的表達(dá)變化倍數(shù)。

(G–L) 在RSV感染24h后，對(duì)照組和FTO基因敲除的BEAS-2B細(xì)胞的qPCR分析。

 

（4）FTO調(diào)節(jié)病毒復(fù)制和炎癥反應(yīng)

FTO基因敲除的細(xì)胞中，RSV復(fù)制減少，I型干擾素和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)變化，表明FTO對(duì)RSV復(fù)制和炎癥反應(yīng)有重要作用。

圖4：FTO調(diào)控病毒復(fù)制和炎癥反應(yīng)

(A) m6A比色法分析FTO基因敲除細(xì)胞中mRNA m6A修飾的總體水平。

(B) CCK-8實(shí)驗(yàn)分析RSV感染期間不同時(shí)間點(diǎn)FTO基因敲除細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況。

(C) TCID50法檢測(cè)400 TCID50 RSV感染后FTO基因敲除細(xì)胞中RSV的病毒滴度。

(D-E) 在RSV感染24h后，對(duì)照組和FTO基因敲除的BEAS-2B細(xì)胞的qPCR分析。

(F) 在RSV感染24h后，FTO基因敲除BEAS-2B細(xì)胞中RSV-G和RSV-F蛋白水平的Western blot分析。

(G–J) 在RSV感染24h后，對(duì)照組和FTO過(guò)表達(dá)的BEAS-2B細(xì)胞的qPCR分析。

 

（5）GDF6是FTO的直接靶標(biāo)

通過(guò)MeRIP-seq和RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)GDF6是FTO的潛在靶基因，FTO通過(guò)m6A修飾調(diào)節(jié)GDF6的mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)。

圖5：通過(guò)MeRIP-seq和RNA-seq鑒定FTO靶標(biāo)。

(A) 在RSV感染的BEAS-2B細(xì)胞中，MeRIP-seq檢測(cè)到主要的共有序列“RRACH”。

(B) m6A peaks在mRNA轉(zhuǎn)錄本上的密度分布。

(C) 與對(duì)照組相比，KEGG富集分析與RSV感染的BEAS-2B細(xì)胞中的m6A修飾相關(guān)。

(D) RNA-seq鑒定出在有或沒(méi)有FTO基因敲除的BEAS-2B細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)的基因。

(E-F) 篩選出在MeRIP-seq中下調(diào)且在RNA-seq中上調(diào)的共有基因。

(G) 在RSV感染或未感染的BEAS-2B細(xì)胞中進(jìn)行24小時(shí)qPCR分析。

(H) 在有或沒(méi)有FTO基因敲除的RSV感染BEAS-2B細(xì)胞中進(jìn)行qPCR分析。

(I) 在咽拭子樣本中對(duì)GDF6進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）分析。

(J-K) 在有或沒(méi)有FTO基因敲除的RSV感染BEAS-2B細(xì)胞中對(duì)GDF6進(jìn)行西方印跡（Western blot）分析。

 

參考文獻(xiàn)：

Li Z, Zhang L, Liu Y, Li H, Gong L, Tan X, Tian J, Pi H, Wang B, Zhao Y, Liu D. The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus. iScience. 2024 Oct 18;27(10):111038.doi: 10.1016/j.isci.2024.111038.