近日，華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院和生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室葉邦策教授和尤迪副教授為共同通訊作者、符瑜博士為第一作者在微生物學(xué)領(lǐng)域著名期刊《mBio》上發(fā)表題為《A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria》的科研成果。研究通過ChIP-seq等分析揭示乙酰磷酸（Acetyl Phosphate, AcP）依賴的乙?；揎椌W(wǎng)絡(luò)在放線菌（Actinobacteria）中調(diào)控環(huán)二腺苷酸單磷酸（cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP）穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。研究以紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，S. erythraea）為模型，揭示AcP通過乙?；揎椨绊憙煞N關(guān)鍵蛋白：二腺苷酸環(huán)化酶（Diadenylate Cyclase, DisA）和其轉(zhuǎn)錄抑制因子DasR，從而調(diào)控c-di-AMP合成與降解，維持細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP穩(wěn)態(tài)。其調(diào)控機(jī)制在放線菌中高度保守，并可能對細(xì)胞的生長、發(fā)育和抗生素合成產(chǎn)生重要影響。易基因科技為本研究提供ChIP-seq技術(shù)服務(wù)。

標(biāo)題：A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria（乙酰磷酸依賴的修飾網(wǎng)絡(luò)調(diào)控放線菌中c-di-AMP穩(wěn)態(tài)）

發(fā)表時間：2024-07-09

發(fā)表期刊：mBio

影響因子：IF6.4/Q1

技術(shù)平臺：ChIP-seq等（易基因金牌技術(shù)）

本研究提出一個由乙酰磷酸（AcP）調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)通過DisA和DasR這兩個不同的底物來負(fù)責(zé)c-di-AMP穩(wěn)態(tài)。研究揭示了AcP誘導(dǎo)的乙?；ㄟ^破壞蛋白質(zhì)多聚體化來調(diào)控，從而通過DisA的K66位點(diǎn)乙?；种?span>c-di-AMP合成；而DasR的K78位點(diǎn)乙?；瘎t消除對disA的轉(zhuǎn)錄抑制。研究驗(yàn)證了AcP通過介導(dǎo)平衡c-di-AMP穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵生理作用。進(jìn)一步的研究表明，乙?；?span>DisA和DasR發(fā)生了構(gòu)象變化，這些變化在分化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。鑒于AcP誘導(dǎo)的乙酰化在響應(yīng)環(huán)境脅迫時的廣泛分布以及所鑒定關(guān)鍵位點(diǎn)的高度保守性，研究人員提出c-di-AMP穩(wěn)態(tài)調(diào)控可能是放線菌中心回路的一個基本特性，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞生理的整體調(diào)控。

 

研究要點(diǎn)

c-di-AMP鑒定對于細(xì)菌生長和細(xì)胞生理是必需的，因此本研究的主要挑戰(zhàn)是細(xì)胞信號和刺激如何進(jìn)入決定c-di-AMP濃度的決策過程，以及這些信息如何整合到調(diào)控通路中。研究以S. erythraea為模型驗(yàn)證了AcP依賴的DisA乙酰化及其轉(zhuǎn)錄抑制因子DasR參與協(xié)調(diào)環(huán)境信號和細(xì)胞內(nèi)信號，這對于c-di-AMP穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

具體而言，DisA的K66位點(diǎn)乙?；苯邮Щ钇涠佘账岘h(huán)化酶活性，從而抑制c-di-AMP產(chǎn)生，而DasR的K78位點(diǎn)乙酰化則導(dǎo)致disA表達(dá)增加和c-di-AMP水平升高。因此，AcP是c-di-AMP維持中的一個關(guān)鍵分子開關(guān)，它響應(yīng)環(huán)境變化，可能抑制有效發(fā)育。因此，AcP介導(dǎo)的翻譯后修飾（PTM）構(gòu)成了合成酶/水解酶調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)。

乙酰磷酸（AcP）調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)通路示意圖

 

研究方法

蛋白質(zhì)乙酰化狀態(tài)檢測：通過免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）和免疫印跡（Immunoblotting, IB）分析檢測DisA和DasR的乙?；?。

體外乙?；瘜?shí)驗(yàn)：利用AcP對DisA和DasR進(jìn)行體外乙?；磻?yīng)，驗(yàn)證其乙?；稽c(diǎn)。

質(zhì)譜分析（LC-MS/MS）：鑒定乙?；揎椀奈稽c(diǎn)，確定DisA的K66和DasR的K78為關(guān)鍵乙?；稽c(diǎn)。

酶活性檢測：通過酶活性實(shí)驗(yàn)檢測乙?；瘜?span>DisA二腺苷酸環(huán)化酶（DAC）活性的影響。

基因轉(zhuǎn)錄分析：利用實(shí)時定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）檢測disA基因的轉(zhuǎn)錄水平。

染色質(zhì)免疫沉淀測序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）：分析DasR在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，驗(yàn)證其對disA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

生物物理實(shí)驗(yàn)：圓二色光譜（Circular Dichroism, CD）分析、化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)和生物層干涉（Biolayer Interferometry, BLI）實(shí)驗(yàn)，研究乙酰化對蛋白結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合能力的影響。

細(xì)胞生理實(shí)驗(yàn)：通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同突變株的發(fā)育表型。

 

結(jié)果圖形

（1）AcP依賴的乙?；苯右种?span>DisA的DAC活性

研究發(fā)現(xiàn)，在氮限制條件下，DisA乙?；斤@著升高，且AcP能夠直接乙酰化DisA。體外實(shí)驗(yàn)表明，乙?；?span>DisA的DAC活性降低約75%，表明AcP依賴的乙?；@著抑制了DisA的酶活性。進(jìn)一步的質(zhì)譜分析鑒定出DisA的K66為關(guān)鍵乙?；稽c(diǎn)，位于其DAC結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該位點(diǎn)乙?；瘜?dǎo)致DisA八聚體結(jié)構(gòu)解離，從而抑制其DAC活性，減少c-di-AMP合成。

圖1：AcP誘導(dǎo)的DisA乙?；种破?span>DAC活性。

(A) 在氮充足（N⁺）或氮限制（N^-）條件下，S. erythraea野生型（WT）菌株的DisA乙?；健?span>

(B) 在37°C下，使用10 mM AcP對His標(biāo)簽的DisA蛋白進(jìn)行不同時間點(diǎn)（0、1、3和5h）的乙?；幚?。通過Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測乙酰化水平。

(C) DisA野生型（DisA^WT）和乙?；?span>DisA（DisA^AcP）蛋白的DAC活性。

(D) DisA^WT和DisA^AcP蛋白的圓二色光譜（CD）圖。

(E) DisA的結(jié)構(gòu)域組織以不同顏色的方框表示。

(F) DisA^WT、DisA^AcP、DisA^K66Q和DisA^K66R蛋白的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。

(G) DisA^WT、DisA^K66Q和DisA^K66R蛋白的DAC活性。

 

（2）DisA主要在K66位點(diǎn)乙?；瘯r失活

通過構(gòu)建DisA的K66突變體（K66Q和K66R），研究發(fā)現(xiàn)K66Q突變體的八聚體結(jié)構(gòu)顯著減少，DAC活性亦顯著降低，而K66R突變體表現(xiàn)出與野生型相似活性。這表明K66位點(diǎn)乙?；?span>DisA失活的主要原因。此外，過表達(dá)DisAK66Q的菌株中c-di-AMP水平顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證K66乙?；瘜?span>c-di-AMP合成的抑制作用。

圖2：K66乙酰化對體內(nèi)c-di-AMP合成的影響。

(A)  S. erythraea野生型（WT）、過表達(dá)DisAWT（OdisA^WT）、過表達(dá)DisAK66Q（OdisA^K66Q）和過表達(dá)DisAK66R（OdisA^K66R）菌株在30°C下TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長曲線。

(B) 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的WT、OdisA^WT、OdisA^K66Q和OdisA^K66R菌株中disA基因的轉(zhuǎn)錄水平。

(C) 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的WT、OdisA^WT、OdisA^K66Q和OdisA^K66R菌株的細(xì)胞提取物中細(xì)胞內(nèi)的c-di-AMP水平。

 

參考文獻(xiàn)：

Fu Y, Zhao L-C, Shen J-L, Zhou S-Y, Yin B-C, Ye B-C, You D. A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria. mBio. 2024 Jul 9:e0141124. doi: 10.1128/mbio.01411-24.