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植物由于不能移動，會受諸如風、雪和動物等逆境脅迫，這些脅迫可能會破壞植物結(jié)構(gòu)，因此再生能力對于植物生存至關(guān)重要。近日，北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院李云教授團隊探索了植物刺槐（Robinia pseudoacacia L.）的不定根（Adventitious Roots, ARs）再生過程中DNA低甲基化（Hypomethylation）對基因調(diào)控網(wǎng)絡的作用。研究通過使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine, 5-azaC）處理刺槐下胚軸切段，通過全基因組重亞硫酸鹽測序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)，揭示了低甲基化激活以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡，進而顯著增強不定根再生能力。相關(guān)研究成果以《DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots》為題發(fā)表于《Plant Cell Environ》期刊。深圳易基因為本研究提供WGBS+RNA-seq技術(shù)服務助力揭示刺槐不定根再生過程中的的DNA甲基化調(diào)控機制。

標題：DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots（DNA低甲基化激活以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡，以增強不定根再生）

發(fā)表時間：2025年2月

發(fā)表期刊：Plant Cell Environ

影響因子：IF6.3/Q1

技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq

作者單位：北京林業(yè)大學李云等

DOI：10.1111/pce.15236

本研究利用5-azaC DNA甲基化抑制劑，使根原基的啟動和發(fā)育更早發(fā)生，從而提高刺槐的不定根再生率。WGBS揭示了在5-azaC處理樣本中，整體甲基化水平下降，而在所有背景（包括CHH、CHG和mergedCG）中，低甲基化胞嘧啶位點和區(qū)域增加，從而導致轉(zhuǎn)錄變異。酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）實驗揭示了一個以RpMYB2為中心的轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors, TFs）網(wǎng)絡，這些轉(zhuǎn)錄因子被RpWRKY23、RpGATA23、RpSPL16以及其他基因如RpSDP、RpSS1、RpBEN1、RpGULL05和RpCUV轉(zhuǎn)錄激活，其核定位表明它們可能共定位。酵母單雜交（Yeast One-Hybrid, Y1H）實驗揭示RpMYB2互作蛋白RpGATA23、RpWRKY23與RpSK6、RpCDC48的啟動子互作，而熒光素酶報告基因?qū)嶒灒?span>Luciferase Reporting Assay, LRA）驗證了其與RpSK6結(jié)合。本研究結(jié)果表明，低甲基化介導的轉(zhuǎn)錄組修飾激活了以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡，從而增強了刺槐下胚軸切段的不定根再生能力。這些發(fā)現(xiàn)為通過遺傳改良提高植物再生能力和增加木材產(chǎn)量，同時抵御環(huán)境損害提供了理論基礎。

研究方法

l   植物材料收集與再生：使用刺槐種子萌發(fā)后的下胚軸切段作為實驗材料，分別在含和不含5-azaC的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察不定根再生情況。

l   石蠟切片與解剖分析：對處理和未處理的切段進行石蠟切片，觀察不定根原基的啟動和發(fā)育過程。

l   WGBS分析：分析全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平。

l   RNA-seq分析：分析基因表達差異。

l   實時定量PCR（qRT-PCR）驗證：對RNA-seq結(jié)果中差異表達的基因進行驗證。

l   酵母雙雜交（Y2H）和酵母單雜交（Y1H）實驗：鑒定與RpMYB2互作蛋白，以及這些蛋白與下游基因啟動子的結(jié)合情況。

l   熒光素酶報告基因?qū)嶒灒?span>LRA）：驗證特定轉(zhuǎn)錄因子與目標基因啟動子的結(jié)合。

l   亞細胞定位分析：通過共聚焦顯微鏡觀察關(guān)鍵蛋白在細胞中的定位。

 

結(jié)果圖形

（1）不定根原基的啟動與發(fā)育

研究通過石蠟切片觀察了5-azaC處理和未處理切段的不定根原基啟動和發(fā)育過程。從8日齡幼苗的下胚軸切取1cm長的切段作為外植體，并在切割后的五個時間點（包括切割后的第0天、第1天、第2天、第3天和第4天，分別標記為D0、D1、D2、D3和D4）進行橫截面分析。通過在不同時間點的組織學對比區(qū)分對照組（D1C、D2C、D3C、D4C）和5-azaC處理組（D1T、D2T、D3T、D4T）外植體中原基的發(fā)育進程以及根分生組織的增殖情況。結(jié)果顯示，5-azaC處理顯著加速了不定根原基的啟動和發(fā)育，處理組在第4天即可觀察到不定根的形成，而對照組則未能發(fā)育出完整的不定根（圖1）。這表明5-azaC通過促進細胞分裂和分化，顯著增強了不定根的再生能力。

圖1：不定根形成及橫切切段的解剖學研究。

(a) 1cm長的下胚軸切段放置在含和不含5-azaC培養(yǎng)基上的形態(tài)學特征。

(b) 每段不定根數(shù)量。

(c) 下胚軸切段的解剖結(jié)構(gòu)顯示了不定根原基的啟動和發(fā)育。與對照組相比，處理組（D2T）的不定根原基啟動更早。在（D3T）中形成了根冠，而在（D4T）中原基發(fā)展為功能性不定根，但在（D3C，D4C）中，根分生組織未能發(fā)育。

 

（2）全基因組甲基化圖譜與不定根再生能力

通過WGBS分析，研究發(fā)現(xiàn)5-azaC處理顯著降低了基因組整體甲基化水平，尤其是在CHH、CHG和mergedCG三種序列背景下。在基因組的不同區(qū)域（包括啟動子、基因體和終止子下游區(qū)域），處理組的甲基化水平均顯著低于對照組，尤其是在CHH背景下，甲基化水平降低更為顯著（圖2a-c）。這表明低甲基化可能通過影響基因表達調(diào)控來增強不定根的再生能力。

圖2：5-azaC處理介導全基因組低甲基化。

在5-azaC處理和對照樣本中，第2天和第4天的基因及其±2kb區(qū)域CHH背景（a）、CHG背景（b）和mergedCG背景（c）中的DNA甲基化水平變化。在CHH背景（d）、CGH背景（e）和mergedCG背景（f）中，不同基因組元件（包括啟動子、外顯子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差異甲基化位點（DMCs）數(shù)量。在CHH背景（g）、CGH背景（h）和mergedCG背景（i）中，不同基因組元件（包括啟動子、外顯子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）數(shù)量。

 

（3）低甲基化位點和區(qū)域激活與不定根再生相關(guān)的基因

研究通過分析差異甲基化位點（DMCs）和差異甲基化區(qū)域（DMRs），發(fā)現(xiàn)5-azaC處理顯著增加了基因調(diào)控區(qū)域的低甲基化位點和區(qū)域數(shù)量。特別是在啟動子區(qū)域，低甲基化的DMCs和DMRs數(shù)量顯著多于高甲基化的情況（圖2d-i）。這些低甲基化位點和區(qū)域與不定根再生相關(guān)的基因表達激活密切相關(guān)，如RpMYB2、RpWRKY23等基因在低甲基化后表達顯著上調(diào)。

 

（4）轉(zhuǎn)錄組分析鑒定5-azaC處理激活的基因及低甲基化RpMYB2的潛在互作因子

RNA-seq分析顯示，5-azaC處理顯著改變了基因表達譜，特別是在處理4天后，差異表達基因數(shù)量顯著增加。這些差異表達基因主要包括細胞分裂、細胞分化、激素信號轉(zhuǎn)導等生物學過程（圖3）。其中，低甲基化激活的基因如RpMYB2、RpWRKY23等在不定根再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且這些基因可能通過與其他基因互作來調(diào)控不定根再生。

圖3：DNA低甲基化導致轉(zhuǎn)錄組變化，從而引起基因差異表達。

火山圖展示了D2C與D2T組（a）以及D4C與D4T組（b）之間的差異表達基因（DEGs）。熱圖描繪了D2C與D2T組（c）以及D4C與D4T組（d）之間的差異表達基因。所選上調(diào)和下調(diào)差異表達基因的相對表達量（e）。

 

（5）酵母雙雜交實驗揭示低甲基化RpMYB2在增強生根能力的基因互作網(wǎng)絡中的中心地位

酵母雙雜交實驗結(jié)果表明，低甲基化激活的RpMYB2是基因互作網(wǎng)絡的中心節(jié)點，與多個轉(zhuǎn)錄因子和功能蛋白相互作用，如RpGATA23、RpWRKY23、RpSDP等（圖4）。這些相互作用蛋白在不定根再生過程中發(fā)揮協(xié)同作用，調(diào)控細胞分裂、細胞分化和激素信號轉(zhuǎn)導等過程。

圖4：通過酵母雙雜交實驗檢測蛋白-蛋白互作。展示RpMYB2和RpSDP蛋白與其他蛋白的正向互作。

 

（6）酵母單雜交實驗揭示以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡的進一步見解）

酵母單雜交實驗進一步驗證了RpMYB2互作蛋白與下游基因啟動子的結(jié)合情況。實驗發(fā)現(xiàn)，RpWRKY23和RpGATA23能夠與RpSK6和RpCDC48的啟動子結(jié)合，表明這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達來增強不定根的再生能力（圖5A）。

圖5：通過酵母單雜交和熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治?span>DNA-蛋白互作。

(A)   酵母單雜交（Y1H）展示了不同轉(zhuǎn)錄因子與RpSK6和RpCDC48啟動子之間的相互作用。

(B)   熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示轉(zhuǎn)錄因子RpWRKY23和RpGATA23與RpSK6啟動子的相互作用。

 

（7）熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CRpWRKY23和RpGATA23蛋白與RpSK6啟動子的互作

熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果進一步證實了酵母單雜交實驗的發(fā)現(xiàn)，即RpWRKY23和RpGATA23能夠與RpSK6的啟動子結(jié)合并激活其表達（圖5B）。這表明這些轉(zhuǎn)錄因子在不定根再生過程中通過調(diào)控關(guān)鍵基因的表達發(fā)揮重要作用。

 

（8）亞細胞定位分析揭示以RpMYB2為中心的互作網(wǎng)絡中蛋白的亞細胞定位

亞細胞定位分析顯示，RpMYB2及其互作蛋白主要定位于細胞核，部分蛋白如RpSDP和RpWRKY23還定位于細胞質(zhì)膜（圖6）。這表明這些蛋白在細胞核內(nèi)與其他基因相互作用，調(diào)控基因表達，同時也可能參與細胞質(zhì)膜相關(guān)的生物學過程。

圖6：RpMYB2互作蛋白的亞細胞定位。共聚焦激光掃描顯微鏡圖像顯示了用GFP標記的蛋白的細胞內(nèi)分布。所有研究的蛋白主要定位于細胞核。RpMYB2、RpSDP和RpWRKY23還顯示出在質(zhì)膜定位。

 

結(jié)論和啟示

本研究通過WGBS和RNA-seq技術(shù)揭示了DNA低甲基化在刺槐不定根再生中的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，5-azaC處理通過降低基因組整體甲基化水平，激活了以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡，顯著增強了不定根的再生能力。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解植物再生的分子機制提供了新的視角，還為通過遺傳改良提高植物再生能力和適應環(huán)境脅迫提供了潛在的靶點。

WGBS和RNA-seq技術(shù)在解析植物表觀遺傳調(diào)控中的重要作用

WGBS和RNA-Seq的聯(lián)合應用，研究者能夠從表觀遺傳修飾和基因表達兩個層面，全面解析DNA低甲基化在不定根再生中的調(diào)控機制。通過整合分析，研究者發(fā)現(xiàn)低甲基化位點和區(qū)域的變化直接導致了相關(guān)基因表達的激活，從而促進了不定根的再生。這種協(xié)同分析不僅揭示了DNA甲基化對基因表達的調(diào)控作用，還為理解植物再生過程中的表觀遺傳調(diào)控機制提供了新的視角。

參考文獻：

Hussain SS, Li Y, Liu J, Abbas M, Li Q, Deng H, Abbas S, Han K, Han J, Sun Y, Li Y. DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots. Plant Cell Environ. 2024 Oct 28. doi: 10.1111/pce.15236.