近日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科葉文樂(lè)博士為第一作者，金潔教授、孫杰研究員為共同通訊作者，在腫瘤學(xué)領(lǐng)域國(guó)際頂刊《Molecular Cancer》發(fā)表題為《NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis》的研究論文，研究揭示了NSUN2（NOP2/Sun RNA methyltransferase 2）介導(dǎo)的RNA胞嘧啶-5甲基化（m⁵C）修飾在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia, AML）中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NSUN2在AML患者樣本中異常高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。NSUN2通過(guò)催化FSP1（ferroptosis suppressor protein 1）mRNA 3’UTR的m⁵C修飾，促進(jìn)其被YBX1（Y-box binding protein 1）識(shí)別和穩(wěn)定，從而維持FSP1蛋白水平，保護(hù)AML細(xì)胞免受鐵死亡（ferroptosis）。此外，NSUN2抑制劑MY-1B和FSP1抑制劑iFSP1展現(xiàn)出抗白血病活性，并與鐵死亡誘導(dǎo)劑及標(biāo)準(zhǔn)AML治療藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，為AML治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和聯(lián)合治療策略。深圳易基因提供的RNA-Bis-seq技術(shù)服務(wù)助力研究團(tuán)隊(duì)揭示NSUN2-FSP1軸在急性髓系白血病鐵死亡中的關(guān)鍵表觀調(diào)控機(jī)制。

標(biāo)題：NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis（NSUN2介導(dǎo)FSP1 m⁵C甲基化保護(hù)急性髓系白血病細(xì)胞免受鐵死亡）

發(fā)表時(shí)間：2025年7月21日

發(fā)表期刊：Molecular Cancer

影響因子：IF33.9/Q1

技術(shù)平臺(tái)：RNA-Bis-seq（RNA-BS）、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）

作者單位：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科金潔、孫杰、葉文樂(lè)等

DOI：10.1186/s12943-025-02394-8

RNA m⁵C是一種普遍存在的表觀轉(zhuǎn)錄組修飾，對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵調(diào)控作用。盡管其在實(shí)體瘤中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)，但m⁵C在急性髓系白血病（AML）中的功能圖譜仍然未知。本研究通過(guò)RNA-Bis-seq等實(shí)驗(yàn)揭示NSUN2（主要的RNA m⁵C甲基轉(zhuǎn)移酶）是AML進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子。NSUN2在AML患者樣本中異常高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。功能研究表明，NSUN2促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，在異種移植模型中增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)，并賦予細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抵抗力。從機(jī)制上講，NSUN2催化FSP1 mRNA 3’UTR的m⁵C修飾沉積，促進(jìn)其被m⁵C reader蛋白YBX1識(shí)別和穩(wěn)定。這一NSUN2-YBX1-FSP1軸通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化損傷，保護(hù)AML細(xì)胞免受鐵死亡應(yīng)激。NSUN2或FSP1缺失誘導(dǎo)線粒體重塑，使細(xì)胞易于發(fā)生鐵死亡。野生型NSUN2或FSP1重構(gòu)建挽救鐵死亡抗性，而催化失活的NSUN2（C271A/C321A）或功能缺失的FSP1突變體（G2A/E156A）未能轉(zhuǎn)換這一表型。通過(guò)NSUN2抑制劑MY-1B或FSP1抑制劑iFSP1進(jìn)行藥理學(xué)抑制表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗白血病效應(yīng)，并與鐵死亡誘導(dǎo)劑、標(biāo)準(zhǔn)化療和BCL-2抑制劑維奈托克（venetoclax）產(chǎn)生強(qiáng)大的協(xié)同作用。本研究揭示了NSUN2和FSP1作為AML的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。強(qiáng)調(diào)了將RNA甲基化與鐵死亡逃避聯(lián)系起來(lái)這一新的表觀轉(zhuǎn)錄組機(jī)制，為克服AML治療耐藥性提供了一種雙重策略方法。

研究方法

患者樣本收集：收集303例AML患者的骨髓和外周血樣本，用于分析NSUN2和FSP1的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系。

細(xì)胞培養(yǎng)與處理：使用多種AML細(xì)胞系（如MOLM-13、THP-1等）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括基因敲除、過(guò)表達(dá)和藥物處理等。

RNA-Bis-seq+RNA-seq：分析NSUN2缺失對(duì)AML細(xì)胞中RNA m⁵C修飾的影響，鑒定NSUN2介導(dǎo)的m⁵C修飾位點(diǎn)；對(duì)RNA-Bis-seq和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，篩選與NSUN2介導(dǎo)的m⁵C修飾相關(guān)的差異表達(dá)基因。

基因編輯技術(shù)：通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建NSUN2基因敲除細(xì)胞模型，以及通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建NSUN2和FSP1過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型。

細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和鐵死亡水平等，評(píng)估NSUN2和FSP1對(duì)AML細(xì)胞功能的影響。

動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建NSUN2基因敲除或FSP1基因敲除的AML小鼠模型，觀察其對(duì)AML進(jìn)展的影響。

藥物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)：分析NSUN2抑制劑MY-1B與鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3以及標(biāo)準(zhǔn)AML治療藥物（如阿糖胞苷）的聯(lián)合治療效果。

 

結(jié)果圖形

（1）NSUN2促進(jìn)急性髓系白血病進(jìn)展并預(yù)測(cè)不良預(yù)后

研究人員分析了NSUN2在AML患者樣本中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在AML患者中顯著高于健康供體（圖1a、b），且與不良預(yù)后相關(guān)（圖1c、d）。在體外實(shí)驗(yàn)中，NSUN2基因敲除的AML細(xì)胞增殖能力下降（圖1h、i），克隆形成能力減弱。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，NSUN2基因敲除的AML細(xì)胞在小鼠模型中形成的白血病負(fù)荷減少，生存期延長(zhǎng)（圖1l-n）。

圖1：NSUN2促進(jìn)急性髓系白血病進(jìn)展并預(yù)測(cè)不良預(yù)后。

（a）GSE30029數(shù)據(jù)集中，46名AML患者與31名健康供體的CD34⁺骨髓（BM）細(xì)胞中NSUN2 mRNA水平。

（b）與24名健康對(duì)照相比，303名新診斷AML患者的骨髓細(xì)胞中NSUN2 mRNA表達(dá)水平。

（c）GSE12417數(shù)據(jù)集中，根據(jù)NSUN2中位數(shù)表達(dá)水平分層的AML患者的Kaplan-Meier生存分析。

（d）根據(jù)NSUN2表達(dá)水平分層的AML患者總生存Kaplan-Meier曲線（中位數(shù)截?cái)啵?span>NSUN2低表達(dá)，n=151；NSUN2高表達(dá)，n=152）。

（e）健康供體（N1-N3）和AML患者（P1-P6）原代骨髓樣本NSUN2蛋白水平的Western blot分析。

（f）MOLM-13和THP-1細(xì)胞用對(duì)照shRNA（shCtrl）或兩種獨(dú)立的NSUN2靶向shRNA（shNSUN2#1/#2）轉(zhuǎn)導(dǎo)后的NSUN2敲低效率RT-qPCR驗(yàn)證。n=3。

（g）MOLM-13和THP-1細(xì)胞中NSUN2敲低后Western blot分析。

（h-i）通過(guò)CellTiter-Glo實(shí)驗(yàn)分析NSUN2敲低的MOLM-13（h）和THP-1（i）細(xì)胞的細(xì)胞活性，持續(xù)5天（n=3）。

（j-k）用EdU摻入實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)NSUN2敲低的MOLM-13（j）和THP-1（k）細(xì)胞中的增殖細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。

（l）通過(guò)生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)B-NDG小鼠體內(nèi)白血病負(fù)荷，這些小鼠移植了經(jīng)shCtrl或shNSUN2轉(zhuǎn)導(dǎo)的MOLM-13-luc細(xì)胞。從7-42天，每周進(jìn)行一次生物發(fā)光成像。

（m）對(duì)（l）中小鼠的生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度（光子/秒）進(jìn)行定量分析。

（n）比較移植了shCtrl和shNSUN2轉(zhuǎn)導(dǎo)的MOLM-13細(xì)胞的小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。n=6。

（o）shCtrl或shNSUN2小鼠組的股骨的HE染色代表性圖像。

（p）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓（BM）和脾臟中hCD45+白血病母細(xì)胞的比例（n = 3）。

（q）在第21天被處死的小鼠的脾臟重量（n=3）。

 

（2）NSUN2缺失介導(dǎo)AML細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感

RNA-seq測(cè)序分析顯示，NSUN2缺失的AML細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)通路被抑制（圖2a），而鐵死亡相關(guān)通路被激活（圖2d、e）。盡管在基礎(chǔ)條件下，NSUN2缺失細(xì)胞并未表現(xiàn)出自發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化，但透射電子顯微鏡（TEM）觀察到其線粒體出現(xiàn)鐵死亡特征性的形態(tài)變化（圖2f）。在鐵死亡誘導(dǎo)劑（如RSL3和Erastin）處理下，NSUN2缺失的AML細(xì)胞表現(xiàn)出更高的鐵死亡敏感性（圖2g-j），表現(xiàn)為更低的半抑制。

圖2：NSUN2缺失介導(dǎo)AML細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感。

（a）基因集富集分析（GSEA）顯示，在NSUN2敲低的MOLM-13細(xì)胞中，細(xì)胞周期通路被上調(diào)。

（b）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析MOLM-13和THP-1細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。

（c）在NSUN2敲低后，MOLM-13和THP-1細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的Western blot分析。

（d-e）基因富集圖（d）和熱圖（e）顯示鐵死亡通路在NSUN2缺失的細(xì)胞中顯著富集。

（f）MOLM-13細(xì)胞的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。NSUN2敲低細(xì)胞中的黃色箭頭突出了鐵死亡特征性變化，包括線粒體收縮和嵴解體。

（g-j）MOLM-13（g、i）和THP-1（h、j）細(xì)胞在對(duì)照或NSUN2敲低條件下，用RSL3或Erastin以梯度濃度處理48小時(shí)后通過(guò)CTG實(shí)驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞活性。

（k-l）對(duì)照和NSUN2敲低細(xì)胞用250 nM RSL3處理75分鐘后Fe²⁺探針?lè)跤?，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估。（m-n）對(duì)照和NSUN2敲低細(xì)胞用250 nM RSL3處理75分鐘后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)用BODIPY 581/591 C11染色評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化水平（m）。脂質(zhì)過(guò)氧化水平的定量結(jié)果如圖（n）。

 

（3）FSP1表達(dá)依賴于NSUN2介導(dǎo)的RNA m⁵C修飾

NSUN2缺失導(dǎo)致AML細(xì)胞中RNA m⁵C修飾水平顯著降低（圖3a）。通過(guò)RNA-Bis-seq測(cè)序技術(shù)，研究人員鑒定出NSUN2缺失導(dǎo)致的m⁵C修飾位點(diǎn)變化，其中FSP1 mRNA的3’UTR區(qū)域出現(xiàn)多個(gè)m⁵C修飾位點(diǎn)的低甲基化（圖3g）。NSUN2缺失降低了FSP1 mRNA和蛋白水平（圖3h、i），而重新表達(dá)野生型NSUN2（非催化失活突變體）可以恢復(fù)FSP1表達(dá)。此外，NSUN2與FSP1 mRNA直接互作（圖3j），且這種相互作用依賴于m⁵C修飾（圖3k）。YBX1被鑒定為與FSP1 mRNA相互作用的蛋白（圖3l），其敲低也能降低FSP1水平（圖3m）。NSUN2和YBX1均能穩(wěn)定FSP1 mRNA，其半衰期在NSUN2或YBX1缺失時(shí)顯著縮短（圖3n）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，NSUN2和YBX1的缺失僅對(duì)野生型FSP1-3’UTR報(bào)告基因的活性產(chǎn)生影響，而對(duì)破壞m⁵C修飾位點(diǎn)的突變體無(wú)影響（圖3o、p）。

圖3：FSP1的表達(dá)依賴于NSUN2介導(dǎo)的RNA m⁵C修飾。

（a）通過(guò)點(diǎn)雜交法分析轉(zhuǎn)染shCtrl、shNSUN2#1或shNSUN2#2的MOLM-13和THP-1細(xì)胞中總RNA的m⁵C水平。以甲基藍(lán)（MB）染色作為裝載對(duì)照。

（b）shNSUN2與shCtrl MOLM-13細(xì)胞中，m⁵C位點(diǎn)在5’UTR、CDS、3’UTR區(qū)域密度分布。

（c）通過(guò)Bis-seq鑒定的NSUN2敲低MOLM-13細(xì)胞中差異甲基化位點(diǎn)的火山圖。低甲基化（藍(lán)色）和高甲基化（紅色）位點(diǎn)突出顯示（n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。

（d）在對(duì)照和NSUN2敲低的MOLM-13細(xì)胞中，m⁵C水平在染色體上的平均值。

（e）維恩圖顯示了低甲基化（Bis-seq）和表達(dá)下調(diào)（RNA-seq）的基因交集。FSP1為候選基因。

（f）在NSUN2敲低后，FSP1下調(diào)的RNA-seq結(jié)果（n=3）。

（g）在NSUN2敲低的MOLM-13細(xì)胞中，FSP1 mRNA上八個(gè)胞嘧啶殘基（C1236-C1300）的位點(diǎn)特異性m⁵C水平，通過(guò)Bis-seq定量。

（h-i）NSUN2敲低降低了MOLM-13和THP-1細(xì)胞中FSP1 mRNA（h，qPCR）和蛋白（i，Western blot）水平。

（j）使用抗NSUN2抗體的RIP-qPCR顯示，與IgG對(duì)照相比，FSP1 mRNA顯著富集（n=3）。

（k）使用m⁵C抗體的m⁵C-RIP-qPCR顯示，在NSUN2敲低細(xì)胞中，FSP1的富集度降低（n=3）。

（l）使用抗YBX1抗體的RIP-qPCR檢測(cè)MOLM-13細(xì)胞中富集的FSP1（n=3）。

（m）YBX1敲低破壞MOLM-13和THP-1細(xì)胞中FSP1蛋白表達(dá)。

（n）在轉(zhuǎn)錄終止后用5μg/ml放線菌素D進(jìn)行FSP1 mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。NSUN2敲低降低了MOLM-13細(xì)胞中FSP1的半衰期。

（o）破壞m⁵C位點(diǎn)的FSP1-3’UTR突變方案。293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染shNSUN2/shYBX1和報(bào)告質(zhì)粒（FSP1-3’UTR-WT或FSP1-3’UTR-Mut）。

（p）熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，與shCtrl相比，NSUN2/YBX1敲低抑制了野生型（WT）FSP1-3’UTR的活性（n=3），但對(duì)突變構(gòu)建體沒(méi)有影響。

 

（4）FSP1缺失顯著抑制AML體內(nèi)外進(jìn)展

FSP1在AML患者骨髓樣本中顯著高表達(dá)（圖4a），且其高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)（圖4b-d）。在體外實(shí)驗(yàn)中，FSP1基因敲除的AML細(xì)胞增殖能力下降（圖4g、h），增殖細(xì)胞比例減少（圖4i、j）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，FSP1基因敲除的AML細(xì)胞在小鼠模型中形成的白血病負(fù)荷減少，生存期延長(zhǎng)（圖4k-m），骨髓中人CD45陽(yáng)性白血病細(xì)胞比例降低（圖4n），組織學(xué)檢查也顯示骨髓中白血病細(xì)胞浸潤(rùn)減少（圖4o）。

圖4：FSP1缺失顯著抑制AML體內(nèi)外進(jìn)展。

（a）健康供體（n=24）和AML患者（n=303）骨髓細(xì)胞中FSP1表達(dá)水平的qPCR分析。

（b）TCGA-AML隊(duì)列中，根據(jù)FSP1中位數(shù)表達(dá)水平分層的AML患者的Kaplan-Meier生存分析。

（c）GSE6891隊(duì)列中，根據(jù)FSP1表達(dá)水平分層的AML患者的Kaplan-Meier曲線（FSP1低表達(dá)，n=160；FSP1高表達(dá)，n=160）。

（d）本研究隊(duì)列中，根據(jù)FSP1表達(dá)水平分層的AML患者的Kaplan-Meier曲線（FSP1低表達(dá)，n=151；FSP1高表達(dá)，n=152）。

（e-f）通過(guò)qPCR（e）和Western blotting（f）驗(yàn)證了靶向FSP1（shFSP1#1或shFSP1#2）或?qū)φ?span>shRNA（shCtrl）的shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的MOLM-13和THP-1細(xì)胞的敲低效率。

（g-h）通過(guò)CTG實(shí)驗(yàn)觀察FSP1敲低后MOLM-13（g）和THP-1（h）細(xì)胞隨時(shí)間的生長(zhǎng)能力。

（i-j）通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FSP1敲低的MOLM-13（i）和THP-1（j）細(xì)胞的增殖能力。

（k）通過(guò)尾靜脈注射將轉(zhuǎn)導(dǎo)了針對(duì)FSP1的shRNA（shFSP1）或?qū)φ?span>shRNA（shCtrl）的MOLM-13-luc細(xì)胞注入B-NDG小鼠。在第7、14、21、28、35天通過(guò)熒光成像監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷。

（l）第7、14、21天小鼠平均熒光強(qiáng)度的定量分析。

（m）通過(guò)log-rank檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的B-NDG小鼠的Kaplan-Meier生存曲線，這些小鼠通過(guò)尾靜脈注射了MOLM-13-luc細(xì)胞（對(duì)照或FSP1敲低）。每組n=6。

（n）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)顯示股骨骨髓中hCD45陽(yáng)性母細(xì)胞的比例。

（o）兩組的股骨HE染色。

參考文獻(xiàn)：

Ye, W., Zhao, Y., Zhou, Y. et al. NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis. Mol Cancer 24, 201 (2025). Doi:10.1186/s12943-025-02394-8