近日，浙江省農(nóng)科院亞熱帶作物研究所張培安助理研究員為第一作者、劉冬峰副研究員為通訊作者，在《BMC Plant Biology》雜志發(fā)表題為“Identification of key genes controlling anthocyanin biosynthesis in the fruits of a bud variety of Tarocco blood-orange”的研究論文，研究聚焦中國常見的血橙（蕓香科柑橘屬）品種Tarocco及其在溫州發(fā)現(xiàn)的芽變品種Ouya（MT），討論了MT果實中花青素生物合成受抑制的品質(zhì)特性及分子機制。研究結(jié)果表明，MT果實具有更優(yōu)的糖酸比、更大的果實重量和尺寸，且成熟期比WT提前約1個月，具備較高的推廣價值。在分子水平上，研究人員鑒定出多個與花青素合成相關(guān)的差異表達基因、轉(zhuǎn)錄因子和甲基化相關(guān)基因，并通過WGBS+RNA-seq聯(lián)合分析，驗證了DNA甲基化在花青素積累中的調(diào)控作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅為血橙果實品質(zhì)改良提供了新的基因資源和靶點，也為其他柑橘品種的遺傳改良提供參考。易基因為本研究提供重要的WGBS+RNA-seq技術(shù)服務(wù)，助力揭示花青素生物合成調(diào)控柑橘果實品質(zhì)的表觀新機制。

研究人員收集了Tarocco（野生型，WT）和芽變品種Ouya（MT）的果實，共九個發(fā)育階段，檢測其花青素、可溶性糖和有機酸含量，并在三個發(fā)育階段對轉(zhuǎn)錄組和代謝物進行分析。分析結(jié)果表明，MT是一個新的花青素含量低、糖酸比優(yōu)于WT的血橙品種。與WT果實相比，MT果實中花青素的含量顯著降低，尤其是矢車菊素類花青素（cyanidin-like anthocyanins），而黃酮類化合物含量沒有顯著變化。在WT和MT的三個果實發(fā)育階段，共鑒定出64個差異表達基因（DEGs），包括5個轉(zhuǎn)錄因子（TFs）、5個甲基化相關(guān)基因和1個黃酮類生物合成基因。進一步利用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）構(gòu)建這些TFs的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，經(jīng)5-氮雜胞苷（5-aza）處理的MT果實果肉中，積累的花青素以及一些花青素合成相關(guān)基因的啟動子和基因區(qū)域存在低甲基化。這些結(jié)果為研究DNA甲基化對MT果實中花青素積累的作用提供了新的見解，并為推廣MT作為一個新品種提供支持。

圖形摘要：血橙果實色澤變化機制比較

 

易小結(jié)

該研究通過WGBS+RNA-seq技術(shù)聯(lián)合分析，深入探究了MT果實中花青素合成受抑制的分子機制。不僅為理解DNA甲基化對MT果實花青素積累的影響提供了新見解，而且為MT作為一種新的血橙品種的推廣提供了支持。

WGBS分析揭示了DNA甲基化在花青素合成相關(guān)基因調(diào)控中的重要作用，而RNA-seq則鑒定出多個與花青素合成相關(guān)的差異表達基因、轉(zhuǎn)錄因子和甲基化相關(guān)基因。這些發(fā)現(xiàn)不僅為血橙果實品質(zhì)改良提供了新的基因資源和靶點，也為其他柑橘品種的遺傳改良提供了參考。此外，本研究還強調(diào)了WGBS+RNA-seq技術(shù)在揭示植物次生代謝產(chǎn)物生物合成和調(diào)控機制中的重要作用，為未來類似作物研究提供了有力的技術(shù)支持和應(yīng)用范例，有助于挖掘更多與果實品質(zhì)相關(guān)的基因和調(diào)控元件，推動農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

研究方法

植物材料：收集WT和MT果實樣本，每15天采集一次，共采集九個樣本，每個樣本包含10個果實。

外觀性狀分析：果實重量和尺寸；果皮和果肉顏色參數(shù)。

理化性質(zhì)檢測：可溶性固形物、可溶性糖、有機酸、維生素C和總類胡蘿卜素含量；總花青素及其組分含量分析。

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）：從開花后（days after flowering，DAF）235、265和280天收集的WT和MT果肉中提取總RNA，分別命名為WT1 / MT1、WT2 / MT2和WT3 / MT3并進行高通量測序，每個文庫包含40.8-85.2M的clean reads，與參考基因組比對，篩選出DEGs，并進行KEGG和GO富集分析。

WGCNA分析：構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置相關(guān)參數(shù)后進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、模塊和基因選擇以及模塊基因的功能分析。通過模塊特征基因與樣本性狀的相關(guān)性分析，篩選出與花青素含量和果實品質(zhì)性狀相關(guān)的模塊。

全基因組亞硫酸鹽測序分析（WGBS）+RNA-seq：經(jīng)5-aza處理235DAF收集MT果實，處理7天后，將果實切成兩半，取果肉樣本進行RNA-seq和WGBS分析，分析其DNA甲基化水平和基因表達變化之間的關(guān)系。

結(jié)果圖形

（1）理化性質(zhì)

在160-235 DAF期間，WT果實的果皮顏色比MT果實更橙紅，而220 DAF之前，兩種品種的果肉顏色相似，均未檢測到花青素積累。220 DAF后，MT果肉顏色顯著淺于WT，WT果皮邊緣開始變紅，隨后紅色逐漸向中心擴散，到280 DAF時，整個果肉呈絲狀紅色，而MT僅邊緣有紅色。果皮和果肉的顏色參數(shù)在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出顯著差異，反映了兩種品種果實顏色的變化。

在果實重量、尺寸、可溶性固形物（TSS）、可溶性糖和有機酸含量方面，MT果實的直徑和重量均顯著大于WT，280 DAF時MT果實重量為254.08g，WT為242.36g。MT的TSS含量在190DAF時超過15°Brix，而WT僅為12.91°Brix，且隨著果實成熟，MT的TSS、可溶性糖含量均顯著高于WT，而有機酸含量則相反，尤其是檸檬酸，導(dǎo)致MT的糖酸比在190 DAF后顯著高于WT。此外，280 DAF時，兩種品種果實果肉中的維生素C含量差異不顯著，但WT的類胡蘿卜素含量顯著高于MT。

圖1：Tarocco（WT）及其芽變品種（MT）在不同發(fā)育階段的外觀（A）及果皮和果肉中總花青素含量（B）。

 

（2）總花青素及其組分含量變化

兩種品種果實果皮和果肉中總花青素含量的變化趨勢與果實外觀變化相似，220 DAF之前未檢測到花青素。隨著果實成熟，果肉中總花青素含量相對較低，且在220和235 DAF時兩類品種間無顯著差異。從250 DAF到280 DAF，WT果實的果皮和果肉中總花青素含量均顯著高于MT。在235、265和280 DAF收集的果肉樣本中，共檢測到38種花青素和6種黃烷酮，其中矢車菊素類花青素含量相對較高，且隨著果實成熟，花青素含量在WT中顯著高于MT。此外還檢測到黃酮類化合物含量在WT中也顯著高于MT。在不同組間比較花青素和黃酮類化合物的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)235 DAF時WT和MT果實間有4種差異代謝物，265 DAF時有7種，280 DAF時有19種。在相同品種中，與235DAF相比，265 DAF和280 DAF大多數(shù)（分別為11種和9種）差異代謝物在WT和MT中共同差異合成。

圖2：不同發(fā)育階段 Tarocco（WT）及其芽變品種（MT）果肉中花青素組分熱圖（A）和維恩圖（B-D）。

表1：不同采樣時期WT和MT果肉中主要花青素和黃酮類化合物含量（μg·g?1）。

 

（3）不同發(fā)育階段WT和MT果實的RNA-seq分析

為分析WT和MT果實花青素合成差異的分子機制，研究人員對檢測到花青素組分樣本進行RNA-seq分析。樣本間相關(guān)性分析顯示三個生物學(xué)重復(fù)間具有良好的可重復(fù)性，WT1和WT2間變異性最小，而WT1、MT3、MT1和WT3間差異相對較大。在三個時間點的WT和MT組間進行比較，235 DAF時鑒定出321個DEGs，265 DAF時有734個，280 DAF時有816個，表明隨著果實成熟，兩種品種間DEGs數(shù)量逐漸增加。在這些DEGs中，有64個基因在三個比較組中存在交集，KEGG分析顯示這些交集基因富集在黃酮類生物合成、苯丙素生物合成以及黃酮和黃酮醇生物合成通路中，GO分析則顯示在五個與甲基化相關(guān)的DEGs中富集，且這些DEGs在WT中的表達量均高于MT。

圖3：鑒定并分析Tarocco（WT）和其芽變品種（MT）果肉樣本之間DEGs的功能特征。對以下各組DEGs進行KEGG富集分析：（A）WT 1 與 MT 1，（B）WT 2 與 MT 2，（C）WT 3 與 MT 3；（D）維恩圖展示三個比較組果肉樣本之間共有和特異性基因；（E）對三個比較組中共有的64個DEGs進行KEGG分析。

 

（4）與花青素和果實品質(zhì)性狀相關(guān)的WGCNA模塊鑒定

通過WGCNA，研究人員將基于13個性狀（包括不同花青素組分、可溶性糖和有機酸）的9,571個基因進行分組，構(gòu)建了7個模塊，分別用不同顏色表示。其中，藍色模塊與花青素合成相關(guān)性最高，與總花青素和四種特定花青素組分高度相關(guān)，且富集在黃酮類生物合成、苯丙素生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、花青素生物合成以及苯丙氨酸代謝等代謝通路中；黃色模塊與總花青素和特定花青素組分呈負相關(guān)，但也富集在花青素合成相關(guān)途徑以及光合作用相關(guān)通路中。所有在WT和MT間差異表達的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）被分類到不同模塊中，藍色模塊在三個階段中差異表達的TFs數(shù)量最多，且在三個階段中鑒定出的五個TFs均位于藍色模塊中，表明藍色模塊中的某些DEGs可能是導(dǎo)致WT和MT果實花青素差異積累的關(guān)鍵因子。研究人員將這五個TFs作為中心基因，分析了其與藍色模塊中黃酮類合成相關(guān)基因的調(diào)控關(guān)聯(lián)，分析結(jié)果表明CsATHB40、CsUNE10和CsRuby可以作為調(diào)控蛋白進行自我調(diào)控轉(zhuǎn)錄，并且CsUNE10和CsRuby可以相互調(diào)控，還可以參與調(diào)控藍色模塊中的黃酮類合成相關(guān)基因，如CsPAL1、CsAOC、Cs4CL1、Cs4CL2、CsCHS、CsCHI和CsCOMT。

圖4：基于13個性狀（不同花青素組分、可溶性糖和有機酸）表現(xiàn)，對9571個基因進行WGCNA分組。

（A）左側(cè)顯示7個模塊及其包含的基因數(shù)量。右側(cè)顏色表示特定模塊與處理之間的相關(guān)系數(shù)。

（B-C）KEGG分析顯示，與總花青素性狀相關(guān)性最高的正模塊（藍，B）和負模塊（黃，C）中的基因。

（D）轉(zhuǎn)錄組共表達網(wǎng)絡(luò)分析展示WGCNA篩選出的模塊中涉及的轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因。

 

（5）5-aza處理后的基因表達和DNA甲基化變化

5-aza處理后，MT果實果肉中檢測到花青素的顯著積累。通過比較5-aza處理和對照（CK）樣本的RNA-seq，共鑒定出1,657個DEGs，其中661個上調(diào)，996個下調(diào)。KEGG富集分析顯示，這些DEGs在與花青素合成相關(guān)的苯丙素生物合成和黃酮類生物合成通路中富集。此外，GO富集分析顯示，幾丁質(zhì)和外部包被結(jié)構(gòu)合成類別分別在上調(diào)和下調(diào)基因中富集。在5-aza處理后，與花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因（CsPAL、CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsF3H、CsF3'5'H、CsF3'H、CsDFR和CsANS）的表達水平以及轉(zhuǎn)錄因子（CsWD40和CsAN1）的表達水平均顯著提高，但CsRuby表達未檢測到顯著變化。研究人員對5-aza處理組和CK組進行了WGBS分析，每個樣本獲得＞50.93M clean reads（6.63Gb）。比較CK和5-aza處理樣本之間的DNA甲基化變化模式，發(fā)現(xiàn)CK組中CG和CHG甲基化的比例分別為12.94%和15.52%，而CHH甲基化比例相對較低。此外，在所有CG、CHG和CHH甲基化中，與CK樣本相比，在5-aza處理樣本中，基因的5'和3'區(qū)域（±2K序列）的DNA甲基化水平降低，尤其是在基因啟動子和基因體區(qū)域。分析CK和5 - aza組之間的差異甲基化區(qū)域（DMRs）顯示，在CG、CHG和CHH的所有背景下，高甲基化DMRs數(shù)量均高于低甲基化DMRs，且在啟動子和外顯子中最為顯著。KEGG分析顯示，CG的DMRs在黃酮類生物合成通路中富集。這些結(jié)果表明，5-aza處理通過降低花青素合成相關(guān)基因的啟動子和基因體區(qū)域的DNA甲基化水平，促進了MT果實果肉中花青素積累。

圖5：基于WGBS分析的芽變品種（MT）在5-aza處理后花青素含量、基因表達和甲基化水平的變化。（A-B） 5-aza處理后果肉表型和花青素含量的變化。

（C） 利用RNA-seq分析5-aza和CK果肉中的DEGs。

（D） 這些DEGs的KEGG富集分析。

（E） 5-aza和CK處理后果肉中花青素相關(guān)基因的表達水平。

（F） 合并的CG、CHG和CHH（包括基因體及±2kb區(qū)域）的DNA甲基化圖譜。

（G） 合并的CG、CHG和CHH（3'UTR、5'UTR、外顯子和啟動子）的DMR數(shù)。

（H） 花青素相關(guān)基因（CsCHI、CsUDPG、CsC4H、Cs4CL和CsPAL）啟動子和基因體區(qū)域的甲基化水平可視化。Hyper，高甲基化；Hypo，低甲基化。

參考文獻：Zhang, P., Zhao, Q., Song, Y. et al. Identification of key genes controlling anthocyanin biosynthesis in the fruits of a bud variety of Tarocco blood-orange. BMC Plant Biol 25, 230 (2025). Doi:0.1186/s12870-025-06212-7.