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近日，復旦大學附屬中山醫(yī)院liang bugang、鄭懿民等為并列第一作者，沈英皓、柯愛武為共同通訊作者，在《Hepatology》雜志發(fā)表了題為“The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC”的科研論文。該研究聚焦肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）中侖伐替尼（Lenvatinib）耐藥這一臨床難題，通過一系列實驗探究了其耐藥機制。研究利用轉錄組和蛋白質組測序分析，揭示了微管相關絲氨酸/蘇氨酸激酶樣蛋白（Microtubule-associated serine/threonine kinase-like, MASTL）在侖伐替尼耐藥的 HCC 細胞和組織中高表達，并通過染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等研究進一步揭示應激激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 24（Serine/threonine protein kinase 24, STK24）調控的 MASTL/YBX1/PAK4 軸在 HCC 中介導侖伐替尼耐藥和腫瘤進展的關鍵作用，為突破HCC 侖伐替尼耐藥提供了潛在的治療靶點。易基因為本研究提供了ChIP-seq技術服務，助力揭示MASTL信號軸在耐藥中的關鍵作用。
論文標題：The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC（應激激活的STK24調控MASTL/YBX1/PAK4軸介導肝細胞癌侖伐替尼耐藥和腫瘤進展）
發(fā)表時間：2025年6月2日
發(fā)表期刊：Hepatology
影響因子：IF15.8/Q1
技術平臺：轉錄組、蛋白質組、表觀基因組（ChIP-seq）等（易基因金牌技術）
作者單位：復旦大學附屬中山醫(yī)院
DOI：10.1097/HEP.0000000000001392
許多肝細胞癌（HCC）患者對侖伐替尼治療反應不佳。因此，闡明耐藥的潛在機制并制定有效的逆轉策略至關重要。本研究首先對侖伐替尼耐藥的細胞系和患者來源樣本進行轉錄組和蛋白質組測序分析，確定MASTL是與HCC中侖伐替尼耐藥密切相關的關鍵因子。隨后，研究人員利用皮下注射小鼠模型、半數抑制濃度（IC50）實驗和集落形成實驗，揭示了MASTL在促進腫瘤生長和介導侖伐替尼耐藥的生物學功能。為進一步闡明潛在機制，免疫共沉淀和質譜分析揭示了MASTL促進YBX1蛋白磷酸化。通過染色質免疫沉淀實驗（ChIP-seq），研究進一步驗證磷酸化的YBX1在轉錄水平上介導PAK4激活，確定PAK4是MASTL通路的下游效應分子。此外，質譜分析和磷酸化分析表明，STK24可以在侖伐替尼作用下激活HCC中的MASTL。而阻斷MASTL/YBX1/PAK4信號軸可恢復HCC對侖伐替尼的敏感性。
本研究結果表明，由應激誘導的STK24激活MASTL/YBX1/PAK4軸在侖伐替尼耐藥中發(fā)揮關鍵作用。通過靶向MASTL抑制該軸可有效克服HCC中的侖伐替尼耐藥。
研究方法
l 細胞系構建：建立侖伐替尼耐藥的 PLC/PRF/5-R（PLC-R）和 MHCC97H-R（97H-R）細胞系，為后續(xù)研究耐藥機制提供模型。
l 臨床樣本收集：從接受侖伐替尼治療的 HCC 患者中獲取穿刺活檢樣本，根據影像學評估的腫瘤反應情況，將患者分為部分緩解（Partial response, PR）和耐藥（Progressive disease, PD）兩組，同時收集手術樣本及組織微陣列（Tissue microarrays, TMAs）。
l 轉錄組和蛋白質組測序分析：對耐藥細胞系及其對照細胞系進行轉錄組測序，篩選出差異表達基因（Differentially expressed genes, DEGs），通過火山圖、韋恩圖等分析工具，確定MASTL等關鍵基因在耐藥細胞中的異常表達情況，初步揭示耐藥相關的分子變化。
l 免疫共沉淀和質譜分析：利用免疫共沉淀（Co-IP）結合質譜（MS）技術，鑒定與MASTL互作蛋白，進一步通過截短突變體構建等實驗，明確MASTL 與YBX1的互作位點，為深入研究MASTL功能及其在耐藥中的作用機制奠定基礎。
l 染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）：通過 ChIP-seq 技術檢測磷酸化YBX1在基因組上的結合位點，結合 RNA-seq數據，鑒定出PAK4是YBX1的關鍵轉錄靶基因，揭示MASTL通過YBX1調控PAK4表達的分子機制，為解析MASTL信號軸在耐藥中的作用提供直接證據。
l 動物實驗：建立裸鼠皮下移植瘤模型、原位肝癌模型以及患者來源異種移植瘤（PDX）模型，評估MASTL對HCC腫瘤生長和侖伐替尼耐藥的作用，同時分析MASTL抑制劑MKI-1單獨或聯(lián)合侖伐替尼對腫瘤生長的抑制效果，為臨床應用提供有力的實驗依據。
結果圖形
（1）整合轉錄組和蛋白質組分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥HCC細胞系和組織中高表達
研究者們首先通過轉錄組和蛋白質組測序分析，比較分析了侖伐替尼耐藥細胞系（PLC-R和97H-R）與對照細胞系（PLC-C和97H-C）的基因表達和蛋白表達差異。分析結果表明，在97H-R vs 97H-C細胞系、PLC-R vs PLC-C 細胞系以及臨床耐藥與敏感 HCC 組織樣本之間，均存在大量差異表達基因。通過火山圖篩選出符合特定條件（|log2FC|>1且p值<0.05）的DEGs，利用韋恩圖分析發(fā)現7個在不同耐藥細胞系和組織樣本中均上調的基因，并鑒定出MASTL在多種癌癥中與治療耐藥相關，且在本研究的耐藥細胞系和組織樣本中表達顯著升高，進一步通過免疫組化（IHC）分析臨床HCC組織樣本，揭示MASTL高表達患者中侖伐替尼治療耐藥比例更高，表明MASTL與侖伐替尼耐藥密切相關。
圖1：整合轉錄組和蛋白質組分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥的HCC細胞系和組織中高表達。
（A）不同濃度侖伐替尼耐藥細胞系和對照細胞系中侖伐替尼的IC50值。
（B）經侖伐替尼處理的耐藥細胞系和對照細胞系的集落形成實驗（n=6）。
（C）經侖伐替尼處理后0、24、48、72和96小時，耐藥細胞系和對照細胞系的細胞活性。
（D）在接受侖伐替尼治療前被評估為疾病進展（PD）或部分緩解（PR）的患者的MRI圖像。
（E）火山圖顯示在97H-R和97H-C細胞系的轉錄組和蛋白質組測序數據中鑒定的DEGs。
（F）火山圖顯示在PLC-R和PLC-C細胞系以及組織樣本之間轉錄組測序數據中鑒定的DEGs。
（G）維恩圖顯示4個隊列之間上調的DEGs重疊分析。
（H）熱圖顯示維恩圖中的重疊基因。
（I）免疫印跡和qRT-PCR檢測在耐藥細胞系、對照細胞系以及正常肝細胞系L02中相對MASTL表達。
（J）免疫組化顯示在之前PR或PD的HCC組織樣本中相對MASTL表達。
（K）TMA3中MASTL的免疫組化染色（左）。通過MASTL表達分析病例比例（右）。
（2）MASTL過表達與HCC患者不良預后相關
基于TCGA數據庫分析，揭示MASTL在多種癌癥類型（包括HCC）的腫瘤組織中表達高于正常組織。對HCC患者的預后分析表明，MASTL 高表達的患者總生存期（OS）更短，且在本研究收集的HCC樣本中，MASTL表達與惡性表型和不良預后相關。多變量邏輯回歸分析表明，MASTL過表達是 OS 和無病生存期（DFS）的獨立預測因子，強調MASTL作為HCC預后標志物的潛力。
圖2：MASTL過表達與HCC患者不良預后相關。
（A）與TCGA數據庫中的正常組織相比，不同癌癥類型中的MASTL表達水平。
（B）點圖顯示TCGA隊列中50個原發(fā)性HCC樣本和配對正常樣本中MASTL的表達。
（C）分析TCGA數據庫中HCC樣本中MASTL的表達和患者的總生存期（OS）。
（D）qRT-PCR結果顯示5個HCC樣本和配對正常組織中MASTL的表達。
（E）通過點圖定量的免疫印跡檢測5個HCC和配對正常組織中MASTL的表達。
（F）TMA1和TMA2隊列中H&E染色和MASTL染色的代表性圖像。
（G）TMA1和TMA2隊列中以IOD值表示的MASTL表達。
（H-I）基于TMA1和TMA2隊列中MASTL表達的總生存期（OS）（H）和無病生存期（DFS）（I）曲線。
（J）區(qū)分HCC腫瘤和正常組織的AUROC值。
（K）熱圖顯示按MASTL表達分組的270例HCC患者的臨床病理特征。森林圖顯示通過單變量和多變量Cox比例風險回歸分析確定的各種表征對OS和DFS的作用。所有實驗至少重復3次。
（3）MASTL促進HCC細胞系對侖伐替尼耐藥及體內外腫瘤進展
在多種 HCC 細胞系中檢測 MASTL 表達水平，發(fā)現其在部分細胞系中表達較高。通過構建 MASTL 過表達和敲低的細胞模型，發(fā)現 MASTL 表達變化直接影響 HCC 細胞對侖伐替尼的敏感性（圖 3C、D），且 MASTL 過表達增強了細胞的遷移、侵襲和自我更新能力，而敲低則抑制這些過程。在體外實驗中，MASTL 過表達的 HCC 細胞形成的克隆數量增多，耐藥性增強；而在體內皮下移植瘤模型中，MASTL 敲低顯著抑制腫瘤生長和侖伐替尼耐藥，過表達則相反（圖 3E-H）。此外，RNA 測序分析顯示 MASTL 過表達激活了 MAPK 信號通路（圖 3I、J），表明 MASTL 可能通過調節(jié)該通路促進 HCC 腫瘤進展和耐藥。
圖3：MASTL促進HCC細胞對侖伐替尼耐藥及體內外進展。
（A）免疫印跡（上圖）和qRT-PCR（下圖）結果展示不同HCC細胞系中相對的MASTL表達。
（B）免疫印跡和qRT-PCR結果展示MHCC97H細胞中MASTL過表達以及SNU449細胞中MASTL敲低的效率。
（C）MASTL過表達、MASTL敲低和對照細胞系中侖伐替尼的IC50值。
（D）MASTL過表達、MASTL敲低和對照細胞系用侖伐替尼處理的集落形成實驗。
（E–H）使用指定細胞建立皮下腫瘤模型，小鼠接受侖伐替尼或安慰劑治療（n=6）。在指定時間點檢測腫瘤體積，終點時測量腫瘤重量。
（I）氣泡圖顯示MASTL過表達細胞系的KEGG通路分析結果。
（J）免疫印跡分析顯示指定細胞系中MAPK信號通路的激活。
（K）氣泡圖顯示MASTL過表達細胞系的GO：BP分析結果。
