羥甲基化5hmC是哺乳動物基因組上的第六堿基，在發(fā)育、衰老、神經(jīng)退行性疾病、復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點(diǎn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)之前被認(rèn)為是檢測DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)的重亞硫酸鹽測序并不能區(qū)分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。

易基因聯(lián)合劍橋大學(xué)建立了化學(xué)氧化法結(jié)合重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的測序技術(shù)（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術(shù)不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結(jié)合同時單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。

技術(shù)路線

技術(shù)指標(biāo)

技術(shù)優(yōu)勢：

1、DNA甲基化檢測全新的“標(biāo)準(zhǔn)”；

2、單堿基檢測DNA羥甲基化修飾；

3、多重質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)檢測氧化效率和Bisulfite轉(zhuǎn)換率；

4、實(shí)驗(yàn)偏好性低，重復(fù)性高（R2＞0.98）；

5、易基因自主研發(fā)的甲基化特異性多重PCR引物設(shè)計軟件；

6、可滿足多種測序應(yīng)用需求：

（1）全基因組氧化甲基化測序（oxWGBS）

（2）簡化基因組氧化甲基化測序（oxRRBS）

（3）目標(biāo)區(qū)域靶基因氧化甲基化測序（Target-oxBS）。

分析內(nèi)容

樣本及送樣要求

經(jīng)典案例

WGBS+oxWGBS項目文章：

An epigenomic landscape of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer using single-base resolution methylome and

hydroxymethylome. (單堿基oxBS-seq宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌進(jìn)行表觀遺傳學(xué)研究)

1、背景：

有許多研究表明宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展跟異常的表觀遺傳修飾相關(guān)，主要包括胞嘧啶甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC），通過5mC/5hmC對基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控在腫瘤發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用。然而這些研究沒有繪制完整的表觀基因圖譜，不能從健康宮頸到宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）再到宮頸癌（CC）整個發(fā)病機(jī)制中區(qū)分5mC和5hmC。另外通過多組學(xué)綜合分析在宮頸癌中鑒定生物標(biāo)志物的報道數(shù)量十分有限。

2、方法：

本文作者選擇從健康宮頸到CIN到CC的一系列樣本，進(jìn)行全基因組亞硫酸氫鹽測序 (WGBS-seq)、oxWGBS-seq、RNA-seq 和組蛋白修飾數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，以確定CC特異性的潛在表觀遺傳生物標(biāo)記物。

3、結(jié)論：

本研究采用oxBS-seq方法繪制從健康宮頸到CIN到CC樣本在單堿基分辨率下的全基因組5mC/5hmC圖譜。分析CC進(jìn)展過程中DMR和DhMR區(qū)域變化趨勢。GO/KEGG富集分析與DMRs相關(guān)基因 (DAGs) 和DhMRs相關(guān)基因 (DhAGs)。個性化分析DAGs和DhAGs甲基化和羥甲基化水平與基因表達(dá)的關(guān)系。多組學(xué)綜合分析甲基化/羥甲基化與基因組變異的相關(guān)性。對甲基化/羥甲基化與組蛋白修飾關(guān)聯(lián)分析。通過多組學(xué)分析證實(shí)了甲基化/羥甲基化與宮頸癌發(fā)生中的 CNV 無關(guān)，且甲基化/羥甲基化的發(fā)生遠(yuǎn)早于CNV。確定了八個預(yù)后相關(guān)基因，可以作為CC治療的新靶點(diǎn)，這為表觀遺傳學(xué)在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的篩查診斷及預(yù)后提供了重要數(shù)據(jù)支持。

RRBS+oxRRBS醫(yī)學(xué)方向案例：

oxRRBS+RRBS單堿基水平檢測炎癥性腸炎(IBD)小鼠模型的結(jié)腸組織DNA甲基化和羥甲基化

Han Q,et al.Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/-Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.

1、背景：

多項研究表明炎癥性腸炎（IBD）中存在基因組DNA甲基化失調(diào)，然而對DNA羥甲基化水平變化則關(guān)注有限。此前的研究未能分別繪制5hmC和5mC這兩種表觀遺傳標(biāo)記，限制了對IBD和結(jié)直腸癌（CRC）表觀遺傳機(jī)制的理解。

2、方法：

研究利用RRBS+oxRRBS分別繪制了Rag2-/-/Il10-/-H.hepaticus感染的IBD小鼠模型近端結(jié)腸組織DNA甲基化和羥甲基化圖譜，進(jìn)行DNA甲基化/羥甲基化差異分析和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析。

3、結(jié)論：

本研究利用RRBS+oxRRBS技術(shù)鑒定出1606個差異甲基化區(qū)域（DMR）和3011個差異羥甲基化區(qū)域（DhMR）。這些DMR/DhMR與胃腸道疾病、炎癥性疾病和癌癥相關(guān)的基因重疊。研究表明慢性炎癥會引發(fā)基因組甲基化和羥甲基化模式改變，腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵基因表達(dá)變化，并可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生。

RRBS+oxRRBS農(nóng)學(xué)項目文章：

oxRRBS+RRBS揭示了牦牛下丘腦在神經(jīng)調(diào)節(jié)和髓鞘形成中的表觀調(diào)控作用

Chai Z, et al. Genome-Wide DNA Methylation and Hydroxymethylation Changes Revealed Epigenetic Regulation of Neuromodulation and Myelination in Yak Hypothalamus. Front Genet. 2021;12:592135.

1、背景：

5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和 5-羥甲基胞嘧啶 (5hmC) 都是神經(jīng)發(fā)育中重要的表觀遺傳修飾。然而很少有研究在自然高海拔條件下鑒定動物大腦區(qū)域的全基因組5mC和5hmC模式。

2、方法：

利用RRBS+oxRRBS鑒定牦牛和牛的大腦、腦干、小腦、下丘腦的基因組5mC和5hmC位點(diǎn)，繪制基因組DNA甲基化和羥甲基化圖譜，并進(jìn)行DNA甲基化/羥甲基化差異化分析和對應(yīng)轉(zhuǎn)錄組的關(guān)聯(lián)分析。

3、結(jié)論：

本研究利用RRBS+oxRRBS技術(shù)發(fā)現(xiàn)牦牛和牛的下丘腦和其他大腦區(qū)域的5mC和5hmC存在顯著差異，鑒定出差異甲基化區(qū)域（DMR）和差異羥甲基化區(qū)域（DhMR），其中大多數(shù)彼此重疊。最后，驗(yàn)證了DMRs和DhMRs調(diào)控的差異表達(dá)基因（DEG）可能在神經(jīng)調(diào)節(jié)和髓鞘形成中發(fā)揮重要作用?？傊Y(jié)果表明， 5mC和5hmC介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控可能廣泛影響下丘腦的發(fā)育及其生物學(xué)功能，可能有助于提高高海拔條件的生理適應(yīng)性。

參考文獻(xiàn)：

①Han Y,et al.An epigenomic landscape of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer using single-base resolution methylome and hydroxy methylome. Clin Transl Med. 2021 Jul;11(7):e498.

②Han Q,et al.Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.

③Chai Z, et al. Genome-Wide DNA Methylation and Hydroxymethylation Changes Revealed Epigenetic Regulation of Neuromodulation and Myelination in Yak Hypothalamus. Front Genet. 2021;12:592135.