CHIP-seq送樣要求
CHIP-seq送樣要求（版本：2021年11月）
A、染色體免疫共沉淀測序（CHIP-seq）
抗體由客戶提供，或者與客戶協(xié)商后可代客戶購買。
【注意事項】抗體應該為ChIP專用的IP抗體
1、細胞樣品處理要求
送樣前需客戶進行交聯(lián)處理。
（1）貼壁細胞：
a)用PBS緩沖液（pH7.4）新鮮配制濃度為1%的甲醛溶液，37℃水浴鍋預熱待用；
b)棄除細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌后（去除干凈），加入預熱的1%新鮮配制的甲醛溶液，對于轉錄因子或DNA結合蛋白，37℃細胞培養(yǎng)箱孵育10-15min固定；對于組蛋白修飾研究，37℃細胞培養(yǎng)箱孵育5-8min。轉錄因子等研究要求直接在培養(yǎng)皿固定，組蛋白修飾優(yōu)先推薦在培養(yǎng)皿直接固定，可接受胰蛋白酶消化細胞懸液后固定，（10cm細胞培養(yǎng)板需要10ml，15cm細胞培養(yǎng)板需要15ml）；
c)棄除甲醛溶液，分別用預冷的1×PBS+BSA（5mg/ml）緩沖液及預冷的1×PBS緩沖液清洗細胞各一次（10cm細胞培養(yǎng)板需要10ml，15cm細胞培養(yǎng)板需要15ml）；
d)在細胞培養(yǎng)板上均勻滴上500ul冰預冷的PBS完全液（PBS+1×PIC蛋白酶抑制劑）；
e)用刮板將細胞從培養(yǎng)板上刮下來，收集至EP管中；
f)2500rpm離心1分鐘；
g)移除上清，輕彈管壁使收集的細胞重懸于殘余的PBS中；
【注意事項】-80℃凍存，干冰寄送，每個樣本細胞量不低于107
（2）懸浮細胞樣本處理：
a)用PBS緩沖液（pH7.4）新鮮配制濃度為1%的甲醛溶液，37℃預熱待用，每個樣品約10ml；
b)將不少于2X107細胞收集到離心管，500g離心5min棄除細胞培養(yǎng)液；用PBS洗滌，離心后（去除干凈），加入5-10ml預熱的1%新鮮配制的甲醛溶液輕輕重懸細胞，對于轉錄因子或DNA結合蛋白，37℃細胞培養(yǎng)箱孵育10-15min固定；對于組蛋白修飾研究，37℃細胞培養(yǎng)箱孵育5-10min；
c)棄除甲醛溶液后（可用終濃度125mM的甘氨酸中和），分別用約10ml預冷的1×PBS+BSA（5mg/ml）緩沖液及預冷的1×PBS緩沖液清洗細胞各一次；
d)在細胞沉淀中加入約500ul冰預冷的PBS完全液（PBS+1×PIC，蛋白酶抑制劑），轉入1.5ml的離心管，2000rpm離心1分鐘；
e)移除上清，輕彈管壁使收集的細胞重懸于殘余的PBS中；
【注意事項】-80℃凍存，干冰寄送，每個樣本細胞量不低于107
2、動物組織樣品處理要求
a)盡快取下組織，去除其他附著組織如脂肪組織等；
b)剪開主血管，用冰冷的PBS 緩沖液（pH7.4）洗去血液；
c)盡量去除組織表面液體后放置到凍存管，液氮速凍后-80℃保存；
【注意事項】整個處理過程中要注意外源物種組織或者細胞污染，處理時間不要太長，最好不要超過1小時，且在冰上操作。
a)樣品需求量：每次ChIP 反應起始量為：人或者小鼠的組織：0.6 g 以上；（以上起始量根據(jù)小鼠組織實驗結果，其他物種根據(jù)基因組大小起始量按比例調(diào)整）
b)樣品必須使用干冰運輸，時間盡量不要超過 72 小時，同時請用 Parafilm 膜將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。
【注意事項】在運輸過程中一定不能出現(xiàn)凍融現(xiàn)象出現(xiàn)，如果發(fā)現(xiàn)凍融現(xiàn)象建議重新寄樣品。
a)請客戶仔細處理樣品，盡量避免污染和運輸途中出現(xiàn)凍融，如果樣品珍貴請客戶自行將所送樣品進行保留備份。
3、植物組織樣品處理要求
a)收集1.5g植物材料在50ml的試管中，在試管中加入40ml 1X PBS和1.08ml甲醛（甲醛最終濃度為1%，且交聯(lián)過程在冰上操作），然后在50ml試管的蓋子上打一個小洞。
b)擰上蓋子后放入干燥器中，真空處理10min。小心釋放真空，避免攪拌組織，重復2~3次，使組織呈現(xiàn)半透明狀，且有下沉的的趨勢（如圖所示）。
c)加入2 M甘氨酸2.5 ml，最終濃度為0.125 M，真空處理5 min。
d)將50毫升蓋子上有孔的試管翻轉，倒去PBS、甲醛、甘氨酸混合溶液。
e)加入1x PBS清洗植株兩次，再用水清洗植株一次，丟棄洗滌液。
f)用紙巾把它們擦干，然后用錫箔紙包裹后冷凍在液氮中。
g)(A)在交聯(lián)步驟之前，植物材料漂浮在溶液表面，并被小氣泡覆蓋;葉的背面和正面的顏色不同。(B)固定后，植株明顯浸泡在溶液中，略透明，均勻浸泡在交聯(lián)溶液中。
【注意事項】冷凍組織可在-80℃下保存數(shù)周，寄送過程使用干冰寄送，在運輸過程中一定不能出現(xiàn)凍融現(xiàn)象出現(xiàn)，如果發(fā)現(xiàn)凍融現(xiàn)象建議重新寄樣品。
4、細菌ChIP樣本前處理操作
a)將菌種接種到約10ml的LB培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)過夜；
b)重新接種次培養(yǎng)，放大培養(yǎng)基至約100ml培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600大約在0.6）；
c)加入新鮮的37%的甲醛溶液至終濃度為1%，24℃搖床（約90rpm）交聯(lián)20min，（每100ml培養(yǎng)基加入2.778ml的37%甲醛）；
d)加入新鮮配制的2.5M的甘氨酸，至終濃度為125mM，室溫搖床孵育10min，終止交聯(lián)；
e)6000rpm 4℃離心10min，去上清，收集細胞沉淀；
f)用20ml預冷的TBS（20mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl）重懸菌體，6000rpm 4℃離心10min，去上清，收集細胞沉淀；
g)將菌體用2ml預冷的TBS緩沖液重懸，轉移至1.5ml離心管中，每管1ml，共兩管（一管備用），6000rpm 4℃離心10min，去上清（上清盡可能去除干凈）
h)-80℃凍存，干冰運輸。
5、富集后僅建庫
a)IP后Qubit檢測富集DNA≥5ng，濃度不低于0.5ng/ul；
b)DNA溶解于EB緩沖液（10mM Tris-HCl，pH 7.5-8.5）；
c)提供IP前染色質(zhì)打斷后的電泳圖片，DNA片段分布在100-500bp為宜；
